慢乙肝治療新動向：REP 2139-Ca
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Replicor公司是一家致力於研究「治癒」慢性HBV及HDV病毒感染的公司，REPn2139（REPn9AC』）是他們目前在臨床研究中走的最遠的產品。
一、REP 2139的作用機理
1.REP 2139的靶標-HBsAg
HBsAg（表面抗原）是成熟HBV表面的糖基化包膜蛋白，由HBV外膜基因編碼合成；血清中的HBsAg有Dane顆粒、小球形顆粒和管狀顆粒3種類型。感染者血流中絕大多數為小球形顆粒，病毒活躍複製期中同時有少數長短不一的管型顆粒。小球和管型顆粒是空缺的外殼，不含病毒核心。即使在病毒複製活躍的病例，這些亞病毒顆粒也遠多於含病毒核心的Dane顆粒（10的2次方到5次方倍）[1]。這些分泌到血液循環里的病毒抗原（表面抗原亞病毒顆粒為主）抑制了人體免疫系統對HBV病毒的免疫，在對HBV的「免疫耐受」及慢乙肝的發生髮展過程中扮演了重要角色。也正因為如此，表面抗原成為了目前諸多「免疫治療」方案的靶標，之前介紹的ARC-520中如是，今天介紹的REPn2139-ca中也如是。
2. NAPs
REP-2139是核酸多聚物（nucleicnacid polymers, NAPs）的一種（結構見圖1[2]，REP2139-ca是REP2139的鈣離子的螯合物）。NAPs是一種水溶性的、兩親的、通過磷硫醯化的磷酸二酯鍵使寡核苷酸連接而來的寡核苷酸多聚物（抱歉我不是化學系的不知道怎麼表達這個東西，你們看結構圖就懂了，這個磷酸二酯鍵和DNA的（圖2，來源於wikipedia）是不一樣的，把不做「橋」的剩下的那個氧原子替換成了硫，原先這種修飾是為了抵抗核酸酶的降解，使寡核苷酸鏈更穩定，在這裡，是為了增加多聚物的兩親性）。磷硫醯化對NAPs的抗病毒作用至關重要[3]。
圖1
圖3
研究表明，NAPs與其靶標的結合與磷硫醯化有關、與NAPs的長度有關（大於30個核苷酸有作用，小於等於20個無作用），但與NAPs的序列無關[5]。
在慢乙肝感染的情況下，NAPs與其靶標的互作能抑制HBV表面抗原亞病毒顆粒的組裝和釋放，降低血液循環中表面抗原的水平，從而給人體免疫系統重建以機會。
二、細胞實驗：
研究者在BHK-21細胞系中進行了NAP的細胞學實驗，NAP未處理的細胞內HBsAg散在分布，而NAP處理過的細胞里，亞病毒顆粒組裝被阻斷，HBsAg聚集在核周（圖4右下綠熒光明顯聚集），表面抗原向細胞外的分泌被抑制[6]。
圖4
三、NAP的概念驗證性臨床研究：
1. NAP單葯治療：
REP 101研究[7]：納入8例e抗原陽性、HBV DNA處於10的6-12次方拷貝/ml、肝功能代償、輕到中度纖維化的初治慢乙肝患者，予以每周REPn2055 400mg或REPn2139-ca 500mg 靜脈滴注治療。血清學療效方面，有7例患者治療過程中HBsAg顯著下降（圖5），並伴有不同程度的抗-HBs的增加（圖6，有回落現象）。
圖5
圖7
該研究中，部分患者雖然有表面抗體的增加，但回落現象明顯，且持續病毒學應答患者比例較小，提示HBsAg的清除雖然的確能使人體對HBV的免疫力得到一定程度的恢復，但NAP單葯治療的效果似乎不夠。所以，研究者隨後進行了NAP聯用免疫調節治療的嘗試。
2. REP 2139-Ca的基礎上後期聯合免疫調節治療：
REP 102研究：一項概念驗證性II期臨床研究，摘要及海報陸續在2013 EASL會議、2015nEASL會議（O114[8]）、2015年VHEP會議[9]及2016年APASL會議（PL-3[10]）上發表。
該研究納入12例e抗原陽性的初治慢乙肝患者（基線HBVnDNA 10的5-8次方 拷貝/ml），首先予以每周REPn2139-Ca 500mg單葯靜滴2h治療，共持續20-24周，治療過程中平均HBVnRNA（紅）、HBVnDNA（黑）、HBsAg（藍）均顯著下降（見圖8），有9例實現了表面抗原的清除，剩下的3例未實現HBsAg清除的患者中1例HBsAg下降了1.1nlog IU/ml，另兩例無應答。
圖8
但在表面抗體生成方面，REPn2139-Ca單葯並不能造成很顯著的表面抗體滴度的增加（見圖8紅圈圈出的部分）。
於是研究者隨後給實現了HBsAg清除的患者在REPn2139-Ca的基礎上加上了免疫調節治療（胸腺肽α-1或聚乙二醇干擾素α-2a）13-26周，未實現HBsAg清除的患者予以恩替卡韋挽救治療（見圖9）。
圖9
聯合免疫調節治療以後，肝酶一過性增高的現象非常明顯（見圖10），並伴隨著血清HBVnDNA水平的下降（圖11，提示機體對HBV的免疫力增強）。
圖10
圖11
9例實現了HBsAg清除的患者在聯合免疫調節治療後，表面抗體水平均有不同程度的升高（圖12黑色豎線以右）。
圖12
停葯後12-24周，9例患者中有8例實現了持續病毒學應答，其中4例維持了長期的持續病毒學應答（圖13）。
圖13
可見在NAP治療的基礎上加上免疫調節治療能夠提高血清學療效、增加遠期持續應答率，那麼一開始就聯合NAP及免疫調節治療會如何呢？研究者隨後也做了這樣的嘗試。
3. REP 2139-Ca+免疫調節初始聯合治療
REP 201研究[11]：在2015年VHEP會議上發表
納入了5例慢乙肝患者，每周同時接受REP 2139-ca 500mg（療程見圖14右上角小字）及聚乙二醇干擾素α-2an 180ug治療（48周），其中兩例患者除REP 2139-Ca及聚乙二醇干擾素外，繼續入組前的恩替卡韋口服抗病毒治療。
結果：所有患者均實現了表面抗原的清除。
圖14
所有患者抗-HBs均有不同程度的上升（圖15）。
圖15
圖16
在該研究中，2例合併服用恩替卡韋的患者（綠色、咖啡色）均實現了HBsAg的清除及長期持續病毒學應答，其實一例患者表面抗體的滴度升高顯著，提示核苷（酸）類似物抗病毒治療與NAP可能也有協同作用，為了證實這一點，研究者後續也進行了相關聯合治療的研究。
4. REP 2139-Ca + 核苷（酸）類似物聯合治療的動物實驗
【為了理順思路，因此在臨床研究中插入一段動物實驗，見諒】
該臨床前研究陸續發表在2015nHEPDART會議(absn114[12])、2016nAPASL（P-0329[13]）會議及2016nEASL會議（THU-177[14]）上。
研究者將攜帶DHBV的鴨（動物模型）隨機分為5組，生理鹽水處理組（ip）、REP 2139-Ca單葯組（10nmg/kg ip qd）、替諾福韋單葯組（15mgnpo qd）、REPn2139-Ca + 替諾福韋組、REPn2139-Ca + 替諾福韋n+ 恩替卡韋（1mgnpo qd），每組患者治療4周（圖17虛線以左），停葯後觀察8周（圖17虛線以右）。
結果：替諾福韋單葯組的鴨停葯後均發生血清DHBVnDNA及DHBsAg的反彈，而REPn2139-Ca單葯組的鴨在治療過程中DHBV DNA及DHBsAg顯著下降，停葯後持續應答也較好，這種趨勢在REP 2139-Ca + TDF/TDF+ETV聯合治療組中更明顯。
圖17
研究者同時分析了停葯8周後鴨肝的DHBVnDNA與cccnDNA水平，發現較之替諾福韋單葯組，REPn2139-Ca單葯組及REPn2139-Ca聯合TDF/TDF+ETV組能更有效的降低肝內DHBVnDNA與cccDNA水平（圖18個體情況，圖19平均水平）。
圖18
圖19
該研究提示，REP 2139-Ca與核苷（酸）類似物有協同作用，聯合治療能有效的降低血液循環中的以及肝臟內的各種HBV標誌物（包括cccDNA）。
5. REP 2139-Ca 在HBV/HDV合併感染患者中的應用
由於丁肝病毒的組裝也依賴乙肝病毒的HBsAg，所以理論上REPn2139-Ca也對HBV/HDV合併感染的患者有效。
REP 301研究：一項概念驗證性II期臨床研究（NCT02233075），摘要/海報陸續在2015 EASL會議（LO2[15]、P0659[16]）、2015 ISVHLD會議（O-09[17]）、2015 HEPDART會議（absn60[18]）、2015 AASLD會議（absn31[19]）、2016nAPASL會議（O-130[20]）及2016nEASL會議（FRI-105[21]）上發表。
研究設計（圖20，綠色箭頭表示到目前為止的研究進程）：
該研究納入12例HBV/HDV合併感染、HBsAg＞1000nIU/ml、e抗原陰性、肝功能代償、輕到中度肝纖維化的患者（高加索人種），前15周予以每周REPn2139-Ca 500mg靜滴2h單葯治療；中間15周予以每周REP 2139-Ca 250mg + 聚乙二醇干擾素α-2a 180ug聯合治療；最後33周予以聚乙二醇干擾素單葯治療（即完成48周的療程）。
圖20
研究結果：
安全性：
REP 2139-ca 單葯期間：耐受性可，靜滴過程中可能有發熱、瘙癢、乏力、頭痛的輸液反應，這些不良事件一般可自行恢復，隨著治療次數的增加有逐漸適應的傾向。單葯治療後半程有2例患者出現輕度的、無癥狀的血紅蛋白、血小板、白細胞降低。
對細胞因子的影響：
REP 2139-Ca單葯治療過程中，IFNγ、TNFα、IP-10、IL-1α（未在圖中顯示）及IL-18等細胞因子水平顯著升高（圖21），IL-7及IL-8水平顯著降低，這種趨勢在後期加上免疫調節聯合治療後沒有改變。此外REPn2139-Ca對細胞因子的影響與是否對REPn2139-Ca應答無關。
圖21
血清學應答：
所有患者HBsAg均有不同程度的下降，其中6例患者HBsAg低於檢測下限（1 IU/ml）（圖22下圈），3例患者下降約3 log（圖22中圈），3例患者下降0.5-1.5 log（圖22上圈）。
圖22
開始聯合干擾素治療後，實現了HBsAg清除的患者肝酶反跳現象明顯（圖23左，提示機體的免疫清除），而未實現HBsAg清除的患者肝酶反跳不明顯（圖23右）。
圖23
相應的，實現了表面抗原清除的患者均有顯著的表面抗體的升高（圖24左），而未實現表面抗原清除的患者表面抗體升高不明顯（圖24右）。
圖24
所有患者的丁肝病毒RNA水平均顯著下降(1.5-7nlog)，12例患者中有10例長期隨訪HDVnRNA低於檢測下限（2例HDV RNA反彈的患者HBsAg應答均較差）（圖25）。即使那些經過治療HBsAg仍持續存在的患者，HDVnRNA也仍有顯著下降，提示REP2139-Ca除了通過影響HBsAg裝配和釋放間接影響HDV外，也通過其他未知的方式在丁肝病毒的生活史中發揮了抗病毒作用。
圖25
在該研究中，REPn2139-Ca能同時有效的降低慢乙肝患者的HBsAg及HDV RNA水平，肝酶反跳/表面抗體滴度顯著升高與聚乙二醇干擾素的引入同步，提示REP 2139-Ca與免疫調節劑的聯用有很好的協同作用。此外，REPn2139-Ca對HDV的清除原理似乎與HBV不同。
四、小結
理論上來說，REP 2139-Ca與其靶標的互作能抑制HBV表面抗原亞病毒顆粒的組裝和釋放，降低血液循環中表面抗原的水平，給人體免疫系統重建以空間，給「功能性治癒」慢乙肝以機會。在臨床研究中，REPn2139-Ca單葯治療能有效降低平均HBVnDNA、nRNA 、HBsAg水平及HDVnRNA水平，但並不是所有患者經REPn2139-Ca治療都能實現HBsAg的清除，且其帶來的表面抗體水平的升高及持續病毒學應答仍不能完全令人滿意。
多項研究表明，現有的慢乙肝抗病毒治療手段—干擾素及核苷（酸）類似物均與REP 2139-Ca有較好的協同作用，能提高其表面抗原血清學應答水平和持續病毒學應答率，因此，REPn2139-Ca與現有慢乙肝抗病毒手段的強強聯合（二聯甚至三聯）是頗具前景的研究方向。
但，不得不提的是，REPn2139-Ca為基礎的聯合治療方案的最終療效建立在患者能否實現HBsAg清除的基礎上，那些對REP2139-Ca沒有反應，或者反應不太敏感的患者，例如圖22中圈及上圈的患者，他們的後續治療方案又該如何？此外，單是替諾福韋或聚乙二醇干擾素α-2a的價格已經讓諸多中國患者大呼接受不了，明明頗有療效的替諾福韋＋聚乙二醇干擾素聯合療法也因為價格原因讓眾多醫患望而生畏，更何況加上REPn2139-Ca？
Anyway，目前REPn2139-Ca在HBV及HBV合併HDV領域的研究均只進行到II期臨床，我們且期待其III期臨床結果！
五、參考文獻
[1] SeegernC，MasonnWS．HepatitisnB virus biology．MicrobiolnMol Biol Rev,2000，64：51-68．
[2] M.nBazinet, V. Pantea, V. Cebotarescu et al. On treatment reduction of HBsAg andnHDV RNA with REP2139-Ca and pegylated interferon alpha 2a in Caucasian patientsnwith chronic HBV/HDV co-infection. 2015 HEPDART abs 60 poster.
[3] NoordeennF, Vaillant A, Jilbert AR. Nucleic acid polymers inhibit duck hepatitis B virusninfection in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 2013 Nov;57(11):5291-8.
[4] MAnMahtab, M Bazinet, A Vaillant, REP 9AC』（REP 2139-Ca）-Induced HBsAg clearancenpotentiates response to immunotherapy in patients with chronic HBV infection,n2013 EASL poster
[5] NoordeennF, Scougall CA1, Grosse A et al. Therapeutic Antiviral Effect of the NucleicnAcid Polymer REP 2055 against Persistent Duck Hepatitis B Virus Infection. PLoSnOne. 2015 Nov 11;10(11)
[6]MA Mahtab, M Bazinet, A Vaillant, REP 9AC』（REPn2139-Ca）-InducednHBsAg clearance potentiates response to immunotherapy in patients with chronicnHBV infection, 2013 EASL poster
[7] MAnMahtab, M Bazinet, A Vaillant,Effects of nucleic aicd polymer therapy alone ornin combination with immunotherapy on the establishment of SVR in patients withnchronic HBV infection. 2015 VHEP poster.
[8] L.nJansen1, A. Vaillant, F. Stelma, et al. Serum HBV-RNA levels decline significantlynin chronic hepatitis B patients dosed with the nucleic-acid polymer REP 2139-ca.nJournal of Hepatology 2015 vol. 62:S250 abs & poster
[9] MAnMahtab, M Bazinet, A Vaillant,Effects of nucleic aicd polymer therapy alone ornin combination with immunotherapy on the establishment of SVR in patients withnchronic HBV infection. 2015 VHEP poster
[10] HnW Reesink, L Jansen, NA Kootstra, Serum HBV-RNA levels decline significantly innchronic hepatitis B patients dosed with REP2139-CA. Hepatol Int (2016) 10n(Suppl 1):S2 abs & presentation
[11] MAnMahtab, M Bazinet, A Vaillant,Effects of nucleic aicd polymer therapy alone ornin combination with immunotherapy on the establishment of SVR in patients withnchronic HBV infection. 2015 VHEP poster
[12] J.nQuinet, C. Jamard, A. Vaillant et al.Benefit of interferon-free,nucleic acidnpolymer-based combination therapy for chronic hepatitis B.2015 HEPDART poster.
[13] AndrewnV, Jonathan Quinet, Catherine Jamard et al. Antiviral effect of therapy withnREP 2139-Ca and nucleos(t)ide analogues against HBV in vivo. Hepatol Int (2016)n10 (Suppl 1):S217 abs & poster
[14] J.nQuinet, C. Jamard, A. Vaillant et al. Achievement of surface antigen clearancenin the liver by combination therapy with REP 2139-Ca and nucleoside analoguesnagainst chronic hepatitis B. Journal of Hepatology 2016 vol. 64:S385 abs &nposter
[15] M.nBazinet, V. Pantea, V. Cebotarescu et al. Significant reduction of HBsAg and HDVnRNA by the nucleic acid polymer REP 2139 in caucasian patients with chronic HBV/HDVnco-infection. Journal of Hepatology 2015 vol. 62:S257. Abs & poster
[16] F.nStelma, A. Vaillant, L. Jansen, et al. Cytokine responses in chronic hepatitis Bnpatients dosed with the nucleic-acid polymer REP2139-Ca. Journal of Hepatologyn2015 vol. 62:S567. Abs & poster
[17] MnBazinet, V Pantea, V Cebotarescu et al. REP 2139 monotherapy and combination therapynwith pegylated interferon: safety and
potent reduction of HBsAg and HDV RNA in CaucasiannPatients with chronic HBV/HDV co-infection. Journal of Viral Hepatitis. Vol 22n(Suppl. S2), Oral Presentations 5
[18] M.nBazinet, V. Pantea, V. Cebotarescu et al. On treatment reduction of HBsAg andnHDV RNA with REP2139-Ca and pegylated interferon alpha 2a in Caucasian patientsnwith chronic HBV/HDV co-infection. 2015 HEPDART abs 60 poster
[19] M.nBazinet, V. Pantea, V. Cebotarescu et al. Update on the safety and efficacy ofnREP 2139 monotherapy and subsequent combination therapy with pegylatedninterferon alpha-2a in chronic HBV / HDV co-infection in Caucasian patients. HEPATOLOGY,nOctober, 2015 222A abs 31 & presentation
[20] V.nPantea, A Vaillant, V. Cebotarescu et al. HBsAg and HDV RNA reduction with REP 2139-Canand peg-INF alpha 2a in chronic HBV/HDV infection. Hepatol Int (2016) 10 (Suppln1):S54. Abs & presentation.
[21] MnBazinet, V Pantea, V Cebotarescu et al. Update on the safety and efficacy ofnrep 2139 monotherapyand subsequent combination therapy with pegylatedninterferon alpha-2a in caucasian patients with chronic hbv/hdv co-infection. Journalnof Hepatology 2016 vol. 64:S584.abs & poster
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