不會找科研思路？從一篇 Nature 文獻說起來教你

有很多人提到科研，都很苦惱，不知道從何處下手，尤其是設計科研思路。其實突破就在看文獻。可以說，如果你科研遇到問題了，沒有別的辦法，就是看文獻。

今天我們就和大家來分析一篇文獻，幫大家梳理一下如何從文獻中尋找科研思路。

推薦理由

經典藥物在 Nature 上華麗麗登場，幕後推手是誰呢？看過以後，你會發現你所熟悉的分生實驗都太 low 了。該研究適合領域：免疫學、藥理學、內科學、細胞生物學、分子生物學、化學生物學、藥學。

思路賞析

Th17 細胞分化可能是很多自身免疫性疾病的基礎。作者的研究工作圍繞 Th17 免疫細胞的分化展開。他們選的研究靶點是孤兒核受體 RORγt。選擇靶點的思路可能有：

1. RORγt 是一個三年前剛被證實和 Th17 免疫細胞分化密切相關的新靶點，夠新穎；
2. 作為一種轉錄因子，其藥物篩選有現成的自動化程度高的實驗技術：熒光素酶報告基因技術；
3. RORγt 的內源性配體（膽固醇的代謝產物）在一年前剛被發現，這使得通過激活熒光素酶報告基因系統來反映 RORγt 的轉錄活性變得非常容易，只需改變培養基中膽固醇含量即可。

隨後作者用基因工程技術在 S2 細胞株中建立了針對 RORγt 核受體完整的報告基因篩選系統。通過定點突變和改變培養基中膽固醇水平，都能驗證該細胞株的熒光素酶信號可直接反映 RORγt 受體的核轉錄活性。

而後，作者用這個系統開始篩選藥物，從 4 000 多個化合物中篩選出地高辛及其衍生物是很強的 RORγt 受體抑製劑。作者通過一系列高大上的工作，證實地高辛對 RORγt 的作用又靠譜又純潔。

比如：通過熒光素酶報告基因系統，證實地高辛對其他多種核轉錄因子都沒啥作用；通過化學生物學技術，使 RORγt 受體的內源性配體羥基膽固醇帶上熒光基團，直接觀察到地高辛能抑制它和 RORγt 的結合；更細緻的是，作者通過對 RORγt 受體的配體結合區域進行隨機突變後，篩選出單克隆的細胞株，在 200 個單克隆細胞集落里，挑出了 3 個加了地高辛後熒光素酶信號沒有減弱的細胞，再進行基因測序，分析找到了地高辛和 RORγt 受體直接結合的準確氨基酸位點。

隨後作者在原代培養的 Th17 免疫細胞上證實了地高辛對其分化的抑制作用。作者做了一個全轉錄組基因分析，經過對測序結果的專業分析比對，發現地高辛處理的 Th17 細胞和敲除 RORγt 受體的 Th17 細胞，其轉錄組有 94% 的相同。

除此之外，作者還研究了一堆正常研究可能不會去碰的問題來證實結論的完整性。比如，如何證實地高辛是通過直接抑制 RORγt 受體、而非抑制 RORγt 受體的上下游信號通路來調節基因表達的。作者採取的方法是在一種不表達 ROR 受體的免疫細胞里分別異位表達了 RORγt 受體和另一類與 RORγt 共用相同下游信號通路的同類轉錄因子：RORα。

結果，地高辛只抑制了 RORγt 受體介導的 IL-17 表達變化，對 RORα介導的 IL-17 表達變化無影響，這樣就巧妙的排除了 RORγt 受體的上下游信號通路是地高辛靶點的可能性。

最後，作者關注了地高辛在臨床治療自身免疫疾病的可行性。包括整體動物模型評價、中毒劑量和治療劑量的比較、改構後衍生物毒性和藥理作用的變化等。不過，有意思的是，作者在討論中並沒有特別看重地高辛臨床用於治療自身免疫疾病的價值。他們更感興趣的是，人體內居然會有一種以植物成分洋地黃苷作為配體的受體存在，在生物學上到底意味著什麼呢？

其實近年來已經發現，人體內自身天然存在有洋地黃苷類的化合物，只是生理作用尚不明確，作者認為他們的研究說明，這些內源性地高辛可能是人體內重要的天然免疫化學武器。結論相當有型。

亮點 Idea

>>>>思維 1

如何選擇好的研究靶點？CNS 三大雜誌報道該蛋白的重要生物功能不超過 5 年（本文是 3 年）、該生物功能和你的專業領域高度相關、但該蛋白卻未在你的專業領域研究過，可能就是很好的靶點。

>>>>思維 2

你以為做個藥物對靶點作用的體外實驗、再做個體內靶點的基因敲除對藥物效果的影響實驗，就能妥妥地證明你的葯通過你的靶起作用？不說多的，下這個結論至少還要考慮兩個方面：

一是體外對靶點的作用濃度，和體內產生效應的濃度是否一致？體內有沒有 Biomarker 證實你的藥引起了你的靶的直接變化；

二是你的葯有沒有可能通過影響你的靶上下游信號起作用？

>>>>思維 3

文章說洋地黃苷在體內都天然存在，什麼酒精、甲醛、二甲基亞碸這些工業原料體內也都存在，看來我們的身體真是個小宇宙。這些東西到底在干神馬呢？快去想吧……

>>>>思維 4

原來地高辛能抑制自身免疫疾病，心內科和風濕內科想報課題的醫生朋友們，是不是有種如獲至寶的感覺呢？