博士德生物：ELISA實驗又失敗？你需要注意這三個要點！

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ELISA實驗操作人員經常會遇到自己的檢測數據和相關文獻中的實驗結果差別較大，甚至相反，或與預期不一致的情況，也常常為此感到困惑。博士德ELISA專家針對此現象給您答疑解惑。

引起ELISA測定結果與文獻報導不一致的原因主要有三點：

標本因素
試劑因素
操作因素

1.標本因素

血清是最常用的ELISA標本，血漿一般可視為與血清同等的標本，標本引起的假陽性和假陰性結果主要是干擾性物質所致，分為內源性物質和外源性物質兩種：

內源性物質

有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質，可以不同程度影響檢測結果。常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質和其它物質等。

（1）類風濕因子

人血清中IgM、IgG型類風濕因子（RF）可以與ELISA系統中的捕獲抗體及酶標記二抗的FC段直接結合，從而導致假陽性。

解決該情況的辦法是：

① F(ab)2替代完整的IgG；

②標本用聯有熱變性（63℃，10 min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；

③檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本稀釋液中，使RF降解。

（2）補體

ELISA系統中固相一抗和標記二抗過程中，抗體分子發生變構，其FC段的補體C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q 可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：①用EDTA稀釋標本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加熱血清使C1q滅活。

（3）嗜異性抗體

人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig (s) 結合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動物Ig (s)，但加入量不足或亞類不同時無效。

（4）嗜靶抗原的自身抗體

抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結合形成複合物，在ELISA方法中均可干擾抗原抗體測定結果。為避免以上情況出現，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離後再測定。

（5）醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體

臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使這些病人體內產生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內也可以產生抗鼠Ig (s) 抗體。這些病人ELISA測定時均可產生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig (s)，從而克服由於上述原因造成的假陽性。

（6）交叉反應物質

類地高辛、類AFP樣物質等，是與靶抗原有交叉反應的物質。在用多抗測定抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，也會出現假陽性結果。

（7）標本中其它成分的影響

血清脂質過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結果有干擾作用。

外源性物質

外源性物質常常是由於用於ELISA測定的血標本的採集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。

標本溶血由於各種人為原因引起的標本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中，會導致非特異性顯色，干擾測定結果。為克服上述干擾作用，標本採集時必須注意避免溶血。
標本活化有些細胞因子如EPCR在天然標本中未表露其抗原表位，需經酸處理使其抗原表位暴露，和檢測抗體結合。
標本受細菌污染因菌體中可能含有內源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產生非特異性顯色而干擾測定結果。
標本保存不當在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性；標本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標本宜為新鮮採集；如不能立即測定，5天內測定的血清標本可存放於4℃，1周後測定的血清標本應低溫凍存；凍存後融解的標本，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混合後再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。
標本凝集不全在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液採集後1/2~2h開始凝固，18~24h完全凝固。檢驗工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果；這類情況於次日複查時因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故複查結果變為陰性。為避免上述干擾作用，解決的辦法最好是血液標本採集後必須使其充分凝固後再分離血清，或標本採集時用帶分離膠的采血管或於采血管中加入適當的促凝劑。
標本管中添加物質的影響不同抗凝劑（如肝素，EDTA）的使用，會使血漿的檢測結果存在一定差異。EDTA對金屬離子結合蛋白的測定有影響。
采血試管洗滌不徹底反覆使用易交叉污染。
塑料試管能吸附抗原物質樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性，應選擇優質塑料試管或玻璃管。
組織樣本處理組織樣本一般使用裂解液或物理方法進行勻漿，裂解液中含有的化學試劑可能會產生一定的本底背景，需做陰性對照。特別需注意裂解液中是否含有蛋白變性劑SDS，SDS可能會影響抗原抗體的結合。
細胞樣本注意所培養的細胞來源是否經多次傳代培養，多次傳代的細胞樣本會變異或產生其細胞亞種，使標誌物的含量將會發生改變。有部分標誌物和牛的同源性很高，在測標誌物時需無血清培養，防止胎牛血清的干擾。

2. 試劑因素

選擇試劑時應選擇靈敏度高、特異性好、穩定性好、批間差小、操作方便的試劑。不同廠家的試劑不能混用，包括底物和洗滌液。不同廠家的試劑校準標準有差異，還有抗體，檢測方法，試劑，交叉反應等因素都會導致採用不同廠家的試劑對樣本的檢測結果不一致。有的廠家酶標板孔間CV值大於20%，標記酶的活性及顯色液的穩定性比較差，使用劣質的試劑必然導致結果的假陽性或假陰性。此外，還要注意試劑的批號和出廠日期，雖然試劑的有效期多為1年，最好選擇剛出廠的試劑使用。

有些廠家為了誇大生產ELISA的指標範圍，用一種指標來冒充其它指標，造成各種種屬，各種指標都可以做的假象。比如用TGF beta這樣的指標代替大多數試劑盒的其它指標作為檢測抗體，同樣可以獲得良好的標準曲線。因為TGF beta在大多數哺乳動物中（human, mouse, rat, pig, bovine, etc.）都有廣泛表達，種屬間的氨基酸序列同源性達100%，TGF beta 隨著其他因子的影響，其表達水平也會發生相應的變化，使得客戶難以查覺。鑒別方法如下：

1．利用干擾實驗可辨別ELISA試劑盒是否檢測目的抗原。

a)將針對試劑盒特異性的重組蛋白和試劑盒中的檢測抗體配置成antibody:antigen=1:2的混合孵育液。

b)37℃孵育15分鐘後，代替原試劑盒中的檢測抗體。

c)後續操作按試劑盒說明書進行。

d)如果標曲良好則說明加入的目的抗原和試劑盒抗體不匹配，試劑盒檢測抗體針對的是非目的抗原，該試劑盒為偽劣產品;若標曲無線性，則說明檢測抗體已被目的抗原中和或干擾，該試劑盒針對的是目的抗原。

2．如果購買了同一公司的ELISA試劑盒A和B,利用交叉實驗可辨別ELISA試劑盒真偽。

a)取出試劑盒A的包被板兩條。

b)一條加試劑盒A的標準品，另一條加試劑盒B的標準品。

c)後續操作按試劑盒說明書進行。

d)如果兩條標曲一致說明兩個試劑盒檢測的同一指標而非A和B, 即為偽劣產品；若兩條標曲不一致則說明兩個試劑盒檢測的是不同指標，即該產品為正常的ELISA試劑盒。

3．指標本身也可以鑒定試劑盒的真偽。某些指標從原理上來講，免疫原性差，難以產生對應的抗體，不適合做ELISA。針對這樣的指標，有些廠家也有相應的試劑盒出售。

有些廠家的部分試劑盒已被國內外學者鑒定假貨，如果文獻中使用的試劑盒來源於這些廠家，其檢測結果可能有誤。大家避免使用這些廠家的試劑盒的同時也要對參考文獻中試劑盒來源格外留心，像博士德這種正規廠家生產的高品質的試劑盒才能為您的科研工作保駕護航。

博士德對ELISA產品進行嚴格質檢，並提供詳細數據

3. 操作因素

嚴格按照試劑說明書進行操作。
檢測前應將試劑放置室溫平衡半小時，洗滌液應現用現配，同時觀察濃縮洗滌液中有無結晶，若有結晶應放37℃水浴中融化後方可使用。加入底物TMB時應注意有無顏色變化，若已顯色則可能過期或變質，也不可使用。
加樣後及時放入孵育箱。標本較多時，要分批操作。按照說明書步驟嚴格控制操作時間，防止孵育時間人為延長，導致非特異性結合緊附於反應孔周圍，難以清洗徹底。
封板溫育時，各孔一定要封嚴，防止陽性標本的液體蒸發，不會引起孔間的污染，產生周邊現象從而導致「花板「的出現。
應保證酶標版清潔，整個操作過程中保證酶標版不接觸次氯酸。
加酶試劑後用吸水紙在酶標版表面輕拭吸干。
合理安排檢測量，以免反應板過多造成洗板等待時間長。
用洗板機洗板時，保證洗液注滿各孔，洗板針暢通，洗完版後最好在吸水紙（選擇乾淨，無塵的吸水材料）上輕輕拍干。若血清中的纖維蛋白或洗滌液中有結晶，將堵塞洗板機針孔，造成全堵或半堵狀態，以致使未結合的酶標記物不能完全洗脫，而使最後底物顯色時加深，造成假陽性或花板。廢液瓶裝滿後應及時清空，以防止廢液迴流對管道的污染，而使洗滌不徹底，造成花板。洗板結束後應用蒸餾水徹底清洗管道，以防止廢液在管道中的殘留。洗滌次數及加液量不可完全按照試劑說明書設定，應根據本實驗室的實際情況來設定，開展新項目前，應做好驗證工作，根據洗滌的效果來決定洗滌的次數和加液量。同時應根據儀器維護保養程序，定期對洗板機進行維護保養。
手動洗板時，加洗液要快速，沒有多道移液器可以使用洗瓶。洗液應新鮮配製，以免被其他試劑污染，或染菌。加好洗液後浸泡 30s-1min。甩板倒液要迅速乾脆。倒液後在吸水紙上拍板，選用無粉塵和碎屑的優質吸水紙。需要用力拍板，使孔內沒有可見液體掛壁；但也不能太重，不能讓樣品干太久。酶標板拍干後立即做後續的加液。
加樣量的準確與否，直接影響抗原抗體結合物的濃度，直至最後顯色的深淺。吸嘴插入血清不可太深，若插入太深，吸嘴外壁可能粘連太多血清，輕微的抖動動即可將吸咀外壁的血清濺入其它包被孔中，造成交叉污染。加樣時應儘可能的垂直加樣，並加在包被孔的底部，不可加在孔的上部。標本量大時，可考慮使用排槍加試劑，可提高速度，但使用排槍時應注意吸嘴一定要裝好，不可鬆動，否則會影響加樣量的準確度。加樣時保持顯色劑不外流，顯色劑應避免接觸金屬器械。加終止液時應避免產生氣泡。
加樣時間間隔對結果也有一定的影響，在競爭抑製法試驗中，理論上應該是標本與酶標抗體混合後同時加入反應孔，若標本先於酶標抗體加入反應孔，則標本會先與包被抗體進行反應，造成特異性假陽性。若是有干擾物質存在時表現明顯，在公平條件下，干擾物質與包被抗體的結合能力會低於標本，而在非公平條件下，干擾物質會優先與包被抗體進行結合，出現假陽性。做HBcAb項目時，若標本與酶加樣時間間隔太長，會引起吸光度的趨勢性變化，會造成吸光度的降低。特別是針對臨界值標本，出現假陽性。
洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩衝液，各種試劑盒的洗液不要混用。洗液需要稀釋時，應按要求稀釋。配製洗液應用新鮮的和高質量的超純水或雙蒸水，電導率小於1.5μS/cm,洗液如果結晶應待其溶解後配製。配製後要測定其pH值，使其範圍在7.2-7.4之間。

4. 溫浴因素

使用水浴箱作為溫浴設備時，應注意水的深淺對結果的影響，當水浴箱中水的的實測溫度37℃時，則水面溫度可能只有34℃，空氣溫度更低，甚至只有二十多度，所以當水浴箱中水位過低時則酶標板微孔沒有浸入水中，則反應溫度會達不到37℃，相應的就會影響酶促反應。為防止邊緣效應，酶標板應盡量浸入水中，以保證受熱的均勻。水浴時，酶標板應封好，以免水滴滴入包被孔中，或陽性標本的蒸發。嚴格掌握溫浴時間，不可為了早點出結果擅自縮短溫浴時間。有研究表明，兩次抗原抗體反應在37℃下，經1-2小時，產物可達頂峰。TMB經HRP作用後，約30分鐘顯色可達頂峰。隨即逐漸減弱，至完全消退。

5. 酶標儀

酶標儀應安置在避光條件下，比色前應提前15-30分鐘開機預熱，這樣測定結果會更穩定。為防止顯色的加深或減弱，顯色時間完成後應立即滴加終止液，並在10分鐘內完成比色。比色前還應觀察酶標板中包被孔是否都在一個平面，酶標板也應放平，以免引起酶標儀故障。酶標板從水浴箱取出後應擦凈孔底水滴，若有水滴殘留在孔底，全造成酶標儀讀數錯誤。雙波長測定時，不必要設空白孔，否則會引起測定的負值。

附1：樣本稀釋注意事項

抗原抗體特異性反應時，生成結合物的量與反應物的濃度有關。無論在一定量的抗體中加入不同量的抗原或在一定量的抗原中加入不同量的抗體，均可發現只有在兩者分子比例合適時才出現最強的抗原-抗體反應。樣本濃度和試劑不匹配會影響檢測結果。樣本要合理稀釋，當標本中抗原含量較低時，如果稀釋比例較大，則會使檢測精確度降低。標本中抗原含量過高，如果稀釋比例較小，則會產生Hook效應，得到假陰性結果。採用同步稀釋測定或使用線性範圍高的兩對半定量法可以減少Hook 反應的發生。

附2：移液器使用注意事項

如較長時間不使用，要把移液槍的量程調至最大值的刻度，使彈簧處於鬆弛狀態以保護彈簧，不注意此點容易導致活塞無法回彈。
如果移液器每天都需要使用，則建議每三個月校準一次，若未經校準，則有可能引起較大的移液誤差，影響檢測結果。並用肥皂水或消毒乙醇，再用蒸餾水清洗，自然晾乾
清潔移液器步驟：
（1）按說明書拆開移液器。（2）檢查並擦拭灰塵和污跡。（3）只能用70%的乙醇擦拭，管嘴連件和推出器可浸泡在肥皂水或者異丙醇溶液中兩小時。有替換濾芯的型號產品要及時更換臟掉的濾芯，以保證腔體內的清潔。（4）活塞、O形環和彈簧塗上硅油（沒有硅油凡士林也可）。（5）裝上並復原移液器。

綜上所述，當ELISA測定結果與預期或文獻報導中不一致時，應綜合考慮標本因素，試劑因素和操作因素等多方面進行分析，並應採取相應措施排除干擾作用，從而為實驗提供正確可靠的檢測結果。