化學專業保研手冊-第十二章：化學前沿（用於活體成像硫化氫分子的熒光探針）

硫化氫（H2S）是自然界中存在的毒性最強的物質，主要通過地質活動或微生物產生，吸入少量即可致人死亡。高濃度的硫化氫可以麻痹嗅覺神經，直至中毒都聞不出臭雞蛋味。然而，20世紀90年代以來的研究表明，哺乳動物體內能以可控方式產生H2S，包括非酶催化（存儲硫的釋放和多硫化合物的新陳代謝）和酶催化兩種途徑。該活性硫在維持機體正常生理活動和功能方面發揮著重要作用，被認為是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之後的第三種最重要的氣體信使分子。因此，對H2S在細胞內信號轉導途徑和生物學功能的研究，具有巨大的潛在醫學和生物學價值。此外，對內源性H2S在生物體不同器官中的分布和濃度進行定性定量檢測也具有重要意義。

一、實驗採用NaHS作為H2S的外源性供體的理論依據

1. 在水中，NaHS電離成Na+和HS-，HS-與溶液中H+結合後可生成 H2S；

2. 實驗中一般採用微摩爾濃度級別的NaHS溶液，不會改變體液的pH 值；

3. 在生理pH=7.4的條件下，H2S在人體內主要以HS-的形式存在，HS-：H2S 約為3：1；

4. 將NaHS 溶於水配成 H2S 溶液，其精確度遠高於向水中通入H2S氣體後所得的H2S溶液；

5. Na+在人體體液中大量存在，因此當加入外源性Na+濃度小於或者等於1mM時其對機體的影響可忽略不計。

二、檢測H2S的熒光探針的設計策略

1.基於H2S的還原性

硫化氫中的硫原子顯-2價，有還原性，可以選擇性地將疊氮基、硝基和經胺還原成氨基，將亞硒還原成硒醚，將亞颯還原成硫醚，將氮氧化合物還原成含氮化合物。在還原前一般是強吸電子基團，而還原後一般是強供電子基團，利用還原前後基團性質的變化可以設計出多種多樣的熒光探針。

基於硫化氫還原疊氮基為氨基的反應，人們又設計出具有大的Stocks位移的探針、比率計型探（受環境影響小）、近紅外探針（人體深層檢測）和雙光子探針（對人體傷害小），也有結合ICT（電子推拉系統）、PET原理設計熒光探針的案例。

以下原理常用在此類硫化氫探針的設計中：三苯基膦鹽是常用的線粒體定位基；羥胺是硝基還原成氨基過程的中間體，因此相對於硝基，羥胺更容易被硫化氫還原；硒醚是強供電子基團；氧化硒的吸電子作用使得探針熒光藍移

2.基於H2S的雙親核性

硫化氫探針最大的挑戰在於如何區別硫化氫和其他生物親核物質，例如半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）。在水溶液中硫化氫的pKa約為7，而其他生物硫醇的pKa值更高（Cys約8.3，GSH約9.2）；同時，硫化氫的空間位阻比其他生物硫醇小，所以，在生理條件下，硫化氫是更強的親核試劑。同時，硫化氫可以看做是兩個巰基的結合物，因此，H2S可以經歷雙親核反應和單親核反應（例如雙鍵的加成反應和硫解反應），而生物硫醇是不能發生雙親核反應的，據此可區別H2S和其他生物硫醇。

雙親核反應：H2S與一個親電基團反應後，如果探針中的另一個親電基團的取代位置合適，裸露的巰基可以繼續與之反應。雙親核反應往往伴隨熒光變化。

3.與不飽和雙鍵加成

染料與H2S加成後共軛結構被破壞，熒光增強

4.生成CuS沉澱

硫負離子（S2-）與Cu2+、Zn2+和Hg2+形成穩定的化合物，因此Cu2+、Zn2+和Hg2+與探針分子的絡合與離去成為設計檢測H2S探針的重要手段之一。

當探針與Cu2+形成穩定的金屬化合物後，順磁性的Cu2+中心可以接受熒光團的激發態電子而導致探針熒光猝滅，根據軟硬酸鹼理論，S2-與Cu2+具有更強的結合力，形成的CuS沉澱相對穩定(Ksp=1.26×10^-36 )。因此，加入H2S溶液後，Cu2+可以被置換出來，探針熒光恢復。

5.硫解2,4-二硝基苯醚

在多肽合成過程中2,4-二硝基苯基常用做酪氨酸保護基，一般條件下，硫醇可以脫去該保護基，因此，2,4-二硝基苯基也是設計檢測H2S的探針的常用基團。

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