藍白斑篩選，一種很炫的東西

分子克隆實驗是分子生物學中常見的一個實驗。感興趣的基因插入到表達載體中，而後轉化進入宿主內，但是並非所有質粒都包含目的基因，怎樣篩查出包含有目的基因的菌落呢，這樣的菌落也就是我們所說的陽性克隆。早期的科學家發展了藍白斑篩選這種狂拽炫酷的東西，只需通過菌落的顏色，我們能夠輕鬆找出陽性克隆。今天，小編就為大家簡單介紹下隱含在這種酷炫技術背後的秘密。

（經知乎網友@喵喵咪鴨 提醒後，附上的藍白斑篩選agar plate圖片）

藍白斑篩選的原理

首先我們需要知道是什麼讓菌落顯現出藍白兩色的。其實呢，白色吧，就是菌落本身的顏色，汗。是真的，看一下平板就知道了，菌落就是白色的。那藍色呢？藍色確實是比較神奇的。藍色其實是β-半乳糖苷酶（β-galactosidase enzyme）分解X-gal產生的產物的顏色。X-gal？什麼鬼。它的全名是5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（不要試圖記住全名了，為了記住它，小編已經陣亡）。產物又是啥，產物是一種叫做5-溴-4-氯靛蘭的藍色東東。

大腸桿菌本身是能夠表達β-半乳糖苷酶的（乳酸存在的前提下），所以正常的大腸桿菌無法進行藍白斑篩選，有乳酸存在的條件下，所有菌落都會分解X-gal產生藍色。能夠用來進行藍白斑篩選的菌株，我們管之叫作為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。缺陷就意味這不正常。也就是說能夠進行藍白斑篩選的菌株內的β-半乳糖苷酶的表達是不正常的（小編你好啰嗦）。β-半乳糖苷酶可以拆分成兩個部分，N端和C端。β-半乳糖苷酶缺陷型菌株的基因組中含有表達β-半乳糖苷酶C端的基因，而N端（一個146個氨基酸的短肽，即α肽鏈）的基因被安放到了表達的載體中。N端基因經過改造，中間插入多克隆位點。這段經過改造的N端基因被稱為lacZ基因（見圖1）。

圖1 適用於藍白斑篩選表達載體

LacZ基因是神一般的存在。神在何處，聽小編慢慢道來。缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當菌體中含有帶lacZ的質粒後，質粒lacZ基因編碼的α肽鏈（酶的N端）和菌株基因組表達的β-半乳糖苷酶的C端互補，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用，具有分解X-gal生成藍色物質的能力。這種現象也叫α-互補。操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacZ中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養基中菌落就會呈現藍色。但是當MCS位點上插入DNA片段時，lacZ基因就失活了，它突變了，表達出來的東西連它的兄弟，β-半乳糖苷酶C端都不認識，沒法完成α互補，β-半乳糖苷酶失活，無法分解X-gal，因此菌落就是白色的。好神奇啊？那麼有看官要問了，β-半乳糖苷酶缺陷型菌株都有哪些？與之配套的表達質粒又有哪些呢？小編在這裡簡單列舉幾個常用的：β-半乳糖苷酶缺陷型菌株有DH5alpha、TOP10等；適用於藍白斑篩選的載體有Puc系列（Puc18 ，Puc19）、M13mp系列等。

藍白斑篩選的不足

經過上面啰哩叭嗦的解釋，大家應該明白藍白斑篩選的原理了。但是「再炫的技術，也會有自己的軟肋」，這條至理名言同樣適用於藍白斑篩選 (這是哪裡的至理名言，小編你瞎編的吧！? 額，是的)。藍白斑篩選的不足之處在於，如果在表達載體內插入的基因太短同時沒有破壞掉lacZ的閱讀框，表達的α肽鏈可能還是有些活性的，菌落仍然會顯藍色。這就產生了傳說中的假陰性。

最後解釋下開放閱讀框（open reading frame）：開放閱讀框是基因序列的一部分，包含一段可以編碼蛋白的鹼基序列。由於擁有特殊的起始密碼子和直到可以從該段鹼基序列產生合適大小蛋白才出現的終止密碼子，該段鹼基序列編碼一個蛋白。（這句話完全來在百度百科，如有雷同，那也是來自百度百科）

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