非小細胞肺癌外周血EGFR基因突變檢測方法及應用實例
非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌中最常見的類型,對於有EGFR敏感突變的NSCLC,採用EGFR-TKIs治療能取得明顯的臨床療效。
T790M突變是最常見的EGFR-TKIs耐葯機制,通過對外周血進行EGFR基因突變檢測,可以篩選出EGFR-TKIs治療有效或治療過程中對其產生耐葯的患者,其定量分析不僅在腫瘤的早期診斷中具有重要意義,而且是療效評價及隨訪的重要生物學指標。
部分腫瘤細胞從原發腫瘤組織中脫落進入外周血、胸腔積液、唾液、糞便中,稱為遊離腫瘤細胞,遊離腫瘤細胞發生凋亡或腫瘤細胞在原發腫瘤組織中凋亡壞死後均可釋放DNA到外周血、胸腔積液、唾液、糞便等部位,這些DNA稱為遊離DNA(cfDNA)。
研究證實,釋放入外周血的遊離腫瘤細胞或遊離DNA可一定程度反映腫瘤基因表型。
Karlovich等曾採用不同檢測方法反覆試驗後指出組織突變亦存在假陰性的可能,其原因可歸結為腫瘤異質性,這在檢測耐葯突變T790M時更為突出,也間接證明了血漿代替腫瘤組織做為檢測EGFR突變樣本的優越性。
檢測方法
目前,用於檢測外周血EGFR突變的方法有很多,但是都各有其優缺點,包括:
- 測序法;
- 實時熒光定量PCR(RT-PCR);
- 擴增阻滯突變系統(ARMS);
- 突變富集PCR(ME-PCR);
- 變性高效液相色譜法(DHPLC)及數字PCR等。
測序法
測序法是目前檢測基因突變最基礎、應用最廣、最直接的一種方法,不僅能檢測已知突變,而且能發現新的突變,且費用不高,是目前公認的檢測基因突變的金標準。
該方法的優勢是可以獲得完整基因序列,所以可以發現未知的突變;但靈敏度不高,僅能檢測突變含量在25%-30%以上的樣本,容易出現假陰性。
而NGS二代測序不僅僅可以檢測突變,還可以檢測基因插入或缺失、拷貝數變異以及基因重排,能同時檢測多種基因異常,且解決了一代測序靈敏度不高的問題。
- 優點:金標準、可檢測未知突變、效率高。
- 缺點:價格較高。
RT-PCR
RT-PCR於1996年由美國Applied Biosystems公司推出,該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍,與常規PCR相比,其特異性更強,自動化程度高,目前已得到廣泛應用。該方法可以檢測出含量為1%以上突變,不足之處是檢測依賴於擴增效率,這在一定程度上限制了精確定量檢測。
- 優點:定量、特異性強。
- 缺點:受擴增效率影響。
ARMS
1989年Newton等在PCR的基礎上,建立了AMRS。針對不同的已知突變,設計適當的引物以檢測出突變基因。ARMS法敏感性可達到1%;引入新型探針技術的SARMS和Cobas@敏感性可達0.1%。ARMS的不足之處在於只能檢測已知突變。
- 優點:靈敏度高、檢測通量高。
- 缺點:只能檢測已知突變。
數字PCR
近年來,在數字PCR基礎之上又衍生出如微乳滴磁珠PCR(BEAMing)、微數字PCR(mdPCR)、微滴數字PCR(ddPCR)等敏感性和特異性更高、定量更精確、效率也更高的檢測方法。ddPCR技術檢測敏感性高達0.001%。
- 優點:靈敏度極高、精確定量。
- 缺點:只能檢測已知突變。
表1 不同方法檢測外周血樣本中EGFR突變結果
表1列出了採用不同方法檢測外周血樣本中EGFR敏感突變結果。可以看出,ddPCR、NGS都表現了很高的敏感性。
在EGFR-TKIs治療過程中,所有患者最終均會對EGFR-TKIs產生耐葯,其中T790M突變為最常見的耐葯機制,約佔所有耐葯機制的60%左右。
已有文獻報道,T790M突變在外周血中的出現要早於影像學進展,最早可在影像學進展前16周在外周血中檢測到T790M突變的存在。及時對患者的T790M突變狀態進行動態監測便於醫生做出更好的醫療決策,而用組織做T790M動態監測在真實世界裡受很大限制,並且腫瘤組織有很強的異質性,而以外周血為標本檢測T790M突變相較腫瘤組織則具備了很多優勢。
隨著外周血基因檢測技術的持續進步,其未來的應用範圍將會更多更廣。
應用實例
血漿中EGFR總拷貝數及突變的EGFR拷貝數診斷腫瘤異質性及評估預後
研究招募了36位攜帶EGFR突變的非小細胞肺癌患者,並收集EGFR-TKI治療前後的血液樣本,採用ddPCR技術對血漿中EGFR突變情況進行分析(包括EGFR19Del、EGFR21 L858R、T790M突變及野生型EGFR)。
入組患者統計學分析及臨床特徵
入組36位患者,其中29位為晚期,平均年齡在63歲,69%的女性,55%不吸煙者, 24位患者接受EGFR-TKI治療;7位為早期,平均年齡為64歲,43%的女性,43%不吸煙者。
非小細胞肺癌患者體內總EGFR拷貝數分析
分析比較了晚期患者與早期患者血漿cfDNA中EGFR拷貝數,結果發現,早期患者血漿中EGFR拷貝數要顯著低於晚期患者,不攜帶EGFR突變的晚期癌患者血漿EGFR拷貝數也比早期的要高。在這些患者中,總EGFR拷貝數與腫瘤負荷無相關性。
圖1 晚期非小細胞肺癌患者與早期患者血漿cfDNA中EGFR拷貝數比較
血漿EGFR突變定量分析
檢測發現65%(15/23)晚期非小細胞肺癌患者存在EGFR突變,EGFR突變拷貝數/EGFR野生拷貝數比值從0.001到1.44。EGFR21 L858R突變血漿與組織檢測結果一致性較高,達到83%(5/6)。EGFR19Del突變一致性達到62%。
圖2 EGFR19Del與EGFR21 L858R突變患者血漿cfDNA定量分析
隨後又評估了血液檢測分析在腫瘤異質性上的作用:
在12%患者血漿中檢測到EGFR21 L858R突變,而在腫瘤組織中卻表現為陰性。同樣的情況也出現在EGFR19Del突變檢測中,有31%的患者在血漿檢測陽性,而腫瘤組織中陰性。
T790M突變在腫瘤組織中都未能檢測出,但是血漿檢測中發現有13%的患者存在此突變,突變拷貝數/野生型拷貝數範圍從0.003到0.1不等。
血漿cfDNA同樣檢測到17%的患者存在EGFR雙突變情況,而腫瘤組織中未能檢出,兩位患者組織活檢中分別存在L858R與19Del突變,但在血漿cfDNA中同時檢出存在T790M突變。另兩位患者組織中檢測到19Del突變,但血漿中同時檢出存在L858R突變。
7位早期患者血漿中未能檢測出任何EGFR突變。
血漿EGFR突變定量分析的預後評估價值
圖3 a.晚期患者中不同血漿EGFR突變值OS對比
b.晚期患者中不同血漿EGFR突變值PFS對比
c.晚期患者中不同血漿總EGFR拷貝數OS對比
d.晚期患者中不同血漿總EGFR拷貝數PFS對比
將晚期患者血漿中所含EGFR突變平均值94拷貝/ml作為臨界值,低於此臨界值的患者有著較長的OS值,而高於此臨界值的OS值較短;同樣的結果體現在PFS上。
有意思的是,總EGFR拷貝數低於平均值的患者相比高於平均值的患者有著更長的OS值;在PFS中也存在類似的結果,低於均值的患者平均PFS為783天,高於均值的患者為238天。
晚期患者隨訪過程中血漿EGFR突變情況
晚期患者接受EGFR-TKI治療隨訪過程中也同時連續進行了EGFR突變的定量分析(圖4)。
結果發現,隨訪過程中,血漿中EGFR突變的總量隨著治療過程的進行而減少,從基準線的65%,最好反應的31%,隨疾病進展後又升至42%;19Del突變拷貝數同樣減少,野生型的也減少,但均未達到統計學意義。相反,T790M隨著治療過程的進行,由原來的13%上升到疾病進展後的42%。
圖4 晚期患者治療過程中血漿EGFR突變動態變化
研究結果表明,非小細胞肺癌患者血漿中EGFR含量及突變數分析是一種較好的判斷腫瘤分子特徵及預後評判的工具,治療前EGFR總拷貝數及突變的EGFR拷貝數具有指示臨床預後的作用。
參考文獻
1.Zhang Y, Xu Y, Wang M. Research Advancement on EGFR Mutation Detection of Cell-free DNA and Tumor Cell in Peripheral Blood of Patients with Non-small Cell Lung Cancer. CJLC. 2016 Nov 20; 19(11):766-772
2.Alegre E, Fusco J P, Restituto P, et al. Total and mutated EGFR quantification in cell-free DNA from non-small cell lung cancer patients detects tumor heterogeneity and presents prognostic value. Tumour Biology the Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology & Medicine, 2016:1-8.
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