CRISPR大範圍「脫靶」？可能還需要進一步驗證

01-29

編者按：

CRISPR基因編輯會導致數以百計意想不到的突變？5月30日，《自然-方法》刊登的一篇通信文章顯示，來自美國哥倫比亞大學等研究機構的科學家確認通過CRISPR基因編輯技術成功修復了導致兩隻小鼠失明的基因後，經全基因組測序發現小鼠體內有超過1500個單核苷酸發生突變，並有百個以上的位點發生發生了大片段的缺失和插入。

文章作者認為，在CRISPR平台可以無風險地使用前，尤其是在臨床環境中，可能還需要更多的工作來提高CRISPR/Cas9的精確度。他們建議，未來使用新的CRISPR方法和試劑應考慮使用全基因組測序來確認體內脫靶突變的存在。

在CRISPR技術更多地被用於人體臨床試驗之前，這一提醒值得關注。不過，這篇文章本身也引發了科學家們的討論。中科院上海神經科學研究所研究員仇子龍評論說，這一研究發生大範圍脫靶是「在製作完全性基因敲除小鼠時，在受精卵里注射了過多的Cas9 mRNA和sgRNA導致」，而將CRISPR作為臨床治療手段時則不會這麼做。

中科院上海神經科學研究所研究員楊輝和他的博士研究生唐騁也向《知識分子》分享了他們的觀點。他們認為，這篇通訊文章本身存在爭議，但鑒於CRISPR如此受到廣泛的關注，距離大規模應用如此之近，此時此刻，任何基於事實的質疑聲音都有其價值。

撰文 | 唐騁、楊輝（中科院上海神經科學研究所）

責編 | 陳曉雪

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最近，國際著名期刊《自然》子刊《自然-方法》（Nature Methods）刊登了一篇頗具震撼的論文，其主旨大概就是說目前火熱的基因編輯技術CRISPR/Cas9有可能導致一些不可預料的基因突變，也就是業內所說的「脫靶」（off target）現象[1]。

坦率地說，自從人類開始對基因實施編輯以來，脫靶就一直是一個困擾科學家的難題，而CRISPR/Cas9之所以能從眾多基因編輯技術當中脫穎而出，原因之一就是其極低的脫靶概率[2, 3]。全球多個實驗室將CRISPR/Cas9用於人類疾病的相關基因治療研究，四川大學華西醫院甚至在去年開始將CRISPR/Cas9基因編輯技術用於臨床試驗，嘗試治療晚期肺癌患者。這種時候，突然有研究表示CRISPR/Cas9其實依然有著非常高的脫靶率，甚至可以造成「一千多個」預測之外的基因突變，業內人士可以說是非常震驚。

那麼，這篇論文說的是否有道理呢？

首先必須強調，《自然-方法》刊登的這篇文章不是架構嚴謹的學術論文，而只是一篇簡短的「通信」（correspondence）。這個欄目與其說是正式發表某個科學結論，毋寧說是公開一種想法來讓有條件的實驗室去驗證之。因此，文章本身的實驗和數據也只是展現一種可能性，但並不足以支撐起一個科學結論所需的完整邏輯結構。

經和業內人士交流，我們認為文章主要存在以下幾點爭議：

一，文章總共涉及了三隻小鼠：兩隻實驗，一隻對照。這個數量是嚴重不足的，因為你無法分清這個結果究竟只是這一兩隻動物的「個案」，還是某種普遍的規律，而只有大量的重複才能抹平一隻只小鼠的「個性」，從中總結出最普適的結論。

動物數量和分組上的問題也連帶導致其後期的數據處理有了諸多不合理之處。例如，文章將小鼠身上所有的單核苷酸變異（SNV）全都歸咎於CRISPR/Cas9的脫靶。事實情況是，自然界一切生物無時不刻都在發生基因突變，即使是基因背景高度一致的實驗室近交系小鼠，每個個體之間也依然有著大量的基因差異，而現有的資料庫也不可能完全覆蓋具體每一隻小鼠的SNV。因此僅僅與資料庫當中的「標準模型」或是一隻對照組小鼠的基因相比對，並不能辨明那些SNV究竟是CRISPR/Cas9所為還是其本身就有的基因突變。對照實驗應該分析實驗小鼠的父系母系基因組，看看哪些突變是遺傳的而不是Cas9基因編輯誘導的。

二，實驗只基於一個sgRNA數據。SgRNA的功能是引導Cas9核酸酶作用於基因組的特定位點，然而該sgRNA特異性評分很低，造成許多脫靶效應也在預料之中。其他sgRNA是否也有類似結果並不清楚。

三，應該做一個只注射Cas9蛋白組或Cas9 mRNA組，看看該核酸酶本身是否能導致大量的SNV及DNA插入或缺失（indels）的情況。

四，文章中為了製取CRISPR/Cas9編輯的小鼠，採用了向受精卵當中共注Cas9蛋白以及sgRNA質粒的方法，而這實際上是一種比較「非主流」的設計，蛋白溶劑可能具有一定毒性，質粒表達緩慢且不易降解，可能會影響到整個系統的穩定性。現在比較主流的方案是向受精卵當中共注Cas9的mRNA與sgRNA。儘管我們不好說這種蛋白加質粒的設計會不會增加脫靶率，但是採用一種一般人不會用的實驗方案就會讓其說服力打一定的折扣。

五，對於indels和SNV的驗證上，只顯示了1個SNV的數據（可能因為版面原因），indels是否是真實的，在其他子代及父母中是否也存在，這些文中並沒有說明。

然而，正如該文一開始所說，這只是一篇簡短的闡述想法的通信，其初衷本就是引發討論而非蓋棺定論，在更多證據出來之前，我們既不能輕率地說CRISPR/Cas9有嚴重缺陷或是《自然-方法》登錯了文章。畢竟科學的本質就在於不斷地質疑與討論，既然是質疑，自然就是有的質疑合理，而有的則不那麼合理。

王爾德說過，比遭人議論更糟糕的是無人議論。把任何想法放到檯面上來討論正是科學不斷進步的原動力。CRISPR/Cas9作為一種對人類未來命運休戚相關的重要生物技術，一些謹慎的聲音總是很有意義的。從這個角度講，《自然-方法》敢於刊登一些不同的聲音，讓大家可以換個角度看待問題，也對得起其作為一個國際著名期刊的責任吧。

參考文獻：

1. Schaefer KA, Wu WH, Colgan DF, Tsang SH, Bassuk AG,Mahajan VB. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nat Methods 2017; 14:547-548.

2. IyerV, Shen B, Zhang W et al. Off-targetmutations are rare in Cas9-modified mice. NatMethods 2015; 12:479.

3. SmithC, Gore A, Yan W et al. Whole-genomesequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-basedgenome editing in human iPSCs. Cell StemCell 2014; 15:12-13.

製版編輯：斯嘉麗丨

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