Illumina測序數據的質量控制（QC）-1

參考教程：陳連福 NGS生物信息分析V3.2

高通量測序(如Illumina HiSeq2000/Miseq等)得到的原始圖像數據文件經Casava鹼基識別(Base Calling)分析轉化為原始測序序列（Sequenced Reads），我們稱之為Raw Data或Raw Reads，結果以 FASTQ (簡稱為fq)文件格式存儲，其中包含測序序列（reads）的序列信息以及其對應的測序質量信息。fastq文件通常使用.fq, .fastq, .txt等作為後綴。

得到測序公司的數據後，不管我們是準備自己做進一步分析，還是只按照測序公司的結果撰寫文章，數據的質量都是要檢查一下的。本文就介紹查看測序數據質量的方法。

1.Fastq文件解析

FASTQ是基於文本的，保存生物序列（通常是核酸序列）和其測序質量信息的標準格式。其序列以及質量信息都是使用一個ASCII字元標示，最初由Sanger開發，目的是將FASTA序列與質量數據放到一起，目前已經成為高通量測序結果的事實標準。NCBI Short Read Archive也是這格式，多了一些描述性辭彙而已。

普通Fastq文件：

解釋：

第一行：illumina sequence identifier 序列標示及相關的描述信息。以「@」開頭。

第二行：illumina swquence 序列本身

第三行：Quality score identifier line（consisting of a 「+」）以「+」開頭（不可省略），後面是序列標示、描述信息，或者什麼也不加。

第四行：Quality score 序列質量信息，與序列一一對應，每一個鹼基都有一個質量評分。

1.1鹼基質量說明

鹼基質量即該位置鹼基在測序時的準確率或者錯誤率。其最初在Phred拼接軟體中定義與使用，其後在許多軟體中得到使用。其質量得分與錯誤概率的對應關係見下表：

具體的換算公式：

對於每個鹼基的質量編碼標示，不同的軟體採用不同的方案，目前有5種方案：

目前Illumina機器得到的基本是illumina 1.8方案。

1.2鹼基質量與對應的ASCII字元

2.使用FastQC軟體對NGS數據進行質量統計

2.1FastQC軟體的介紹

FastQC的主頁：FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data

FastQC很很好的檢測NGS數據的好壞，但是不能進行reads 的過濾和修剪。該軟體能在win、max和linux三大平台上運行，且能夠以圖形化或者命令行的方式運行。

2.2FastQC軟體安裝

參考官網的說明進行安裝。要注意其中強調首先要安裝好java，之後才能使用fastqc

這裡舉一個CentOS系統中安裝FastQC的命令：

$ sudo mkdir -p /opt/biosoft #新建biosoft文件夾，所有的生物信息軟體都安裝到該文件夾下$ sudo chmod 1777 /opt/ /opt/biosoft/ #更改該文件夾的屬性$ cd /opt/biosoft/ #進入該文件夾$ wget http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc_v0.10.1.zip #下載fastqc$ unzip fastqc_v0.10.1.zip #解壓$ cd FastQC # 進入解壓後的文件夾$ chmod 755 fastqc #修改許可權使fastqc可以以圖形界面運行$ ./fastqc --help #輸出Fastqc幫助文檔n

如果對linux系統不熟悉，或者後續不需要對數據進行個性分析，可以直接選擇win版本的FastQC軟體進行。

2.3運行Fastqc

FastQC的一個運行實例

1. $ mkdir ~/testData
2. $ cd ~/testData
3. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/fragment.reads1.fastq
4. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/fragment.reads2.fastq
5. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/jumping.reads1.fastq
6. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/jumping.reads2.fastq
7. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/mycelium.reads1.fastq
8. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/mycelium.reads2.fastq
9. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/jumping.reads1.fastq
10. $ wget http://122.205.95.116/train/testData/jumping.reads2.fastq #下載練習數據，該網址已失效。
11. $ mkdir -p ~/dataPreprocessing/FastQC #遞歸創建多層目錄 ~/ 代表宿主目錄（用戶登錄時所在的目錄）
12. $ cd ~/dataPreprocessing/FastQC #
13. $ mkdir rawData
14. $ /opt/biosoft/FastQC/fastqc -t 8 -o ./rawData ~/testData/*.fastq #「opt/biosoft/FastQC」是Fastqc軟體安裝的位置，「fastqc」是正式執行分析的命令，「-t 8 」並行計算8個任務，輸出文件夾為rawData（絕對位置是~/dataPreprocessing/FastQC/rawData）輸入的fastq文件來自~/testData 文件夾中下載的6個fastq文件。
15. $ firefox ./ #用firefox瀏覽器查看結果 「.」 代表當前目錄，「..」 代表上一層目錄

運行分析後，會自動打開firefox瀏覽器：

打開.html文件，就是NGS數據質量分析結果。

2.4 FastQC分析結果說明

FastQC分析結果分為11個部分，我們按照順序對各個部分代表的意義進行詳細說明。下圖左邊就是全部11個分析部分，點擊每個部分，就會跳到相應的結果中。

各項指標的解讀可以參考官網說明：

Index of /projects/fastqc/Help/3 Analysis Modules

下次我會結合官網說明做一個詳細的介紹。
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