【iGEM】華南農業大學項目介紹

（首發於微信公共號：藍晶實驗室 BluephaLab 【iGEM】）

作者：2016 華南農業大學 iGEM隊伍

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編者按：

華南農業大學SCAU-China 參賽隊在2016年iGEM比賽中獲得金獎，獨得「最佳新應用項目獎」、「最佳教育和公眾參與獎」和「植物合成生物學最佳成就獎」 三項單項獎，並獲得全球決賽總季軍。

是什麼樣的項目獲得了如此優異的成績呢？讓我們一起來了解一下。

課題簡介

目前市場上很多藥物、保健品珍貴天然產物的大規模生產都是通過微生物發酵或直接提取而來的，但其工業原料來源儲運受限，產品純度和效率極低。因此如何安全高效，又能低成本大量生產這些珍稀產物就成為一個需要解決的問題。

針對這樣的問題， 我們另闢蹊徑，在項目中利用合成生物學技術，在水稻中重構了蝦青素的合成代謝途徑，以高等植物作為生物反應器合成具有超強抗氧化性的蝦青素。本項目有望降低蝦青素生產的原材料成本，便於原材料儲存和運輸，安全解決生產效率低等工業實際問題，其產物將在抗衰老、抗擊癌症，以及控制人體低密度膽固醇等方面具有廣闊的應用前景。

背景介紹

蝦青素的生物合成

蝦青素(3,3』-二羥基-β,β-胡蘿蔔素-4,4』-二酮)是一種天然酮式類胡蘿蔔素，存在於某些微藻、蝦和鮭魚等動植物中(圖1)。這種化合物不溶於水,溶於大多數有機溶劑。只有某些特定的物種，如藻類(Haematococcus pluvialis)和紅酵母(Phaffia rhodozyma)，能合成蝦青素，動物不能。但許多海洋動物可以通過食物（如藻類）攝取蝦青素。蝦青素是一種強大的抗氧化劑，因此有很好的商業前景的醫療保健價值。

圖1 蝦青素廣泛存在於微藻（左）、蝦（中）和鮭魚（右）等動植物中

目前,工業上一般從微藻（H.pluvialis）、yeast（Phaffia rhodozyma）、蝦的處理廢物和化工產品中提取蝦青素。然而,這些方法並不夠安全，產品很難凈化。而因為高等植物有先進的蛋白質合成系統，能生產複雜的產品（如類胡蘿蔔素、紫杉醇等高級萜類化合物），所以我們認為高等植物能夠作為生產蝦青素的高效、安全的生物反應器。雖然玉米等高等植物能夠合成青素的代謝前體玉米黃質，然而，由於缺乏β-胡蘿蔔素酮酶，仍不能合成蝦青素。

由丙酮酸到蝦青素的生物合成需要十種以上的酶。然而，根據黃金大米的研究,我們推斷其在水稻胚乳里的生物合成需要四個關鍵酶(圖2)。PSY(八氫番茄紅素合成酶)催化焦磷酸香葉酯（geranylgeranyl-PP）為八氫番茄紅素。來自歐文氏菌（Erwinia uredovora）的Crtl基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶，可催化八氫番茄紅素生成番茄紅素。此外, 編碼β-番茄紅素環化酶的β-LCY基因, 在水稻胚乳中表達並激活。因此，當這兩個基因（PSY和Crtl）在水稻中被胚乳組織特異性啟動子驅動時，可合成β-胡蘿蔔素(維他命原A)，即生產出了著名的黃金大米。

圖2 轉基因水稻胚乳中蝦青素的生物合成通路黑色實線箭頭代表玉米等高等植物體內能夠合成的通路，黑色虛線代表高等植物體內不能夠發生的反應，紅色箭頭代表我們新轉入的基因以及能夠發生的代謝反應。

而從β-胡蘿蔔素到蝦青素，仍需兩個步驟：BHY（β-胡蘿蔔素羥化酶）催化β-胡蘿蔔素為玉米黃質和BKT（β-胡蘿蔔素酮酶）直接催化玉米黃質合成蝦青素產品。因為水稻內源的BHY基因的表達水平很低，所以，僅導入三個基因（PSY+CrtI+BKT, BPC）可能僅能合成少量的蝦青素（甚至沒有）。因此，蝦青素在水稻胚乳中的生物合成至少需要四個基因（PSY+CrtI+BKT+BHY, BBPC）。

我們利用多基因載體系統對其進行組裝並導入水稻胚乳來研究蝦青素的代謝合成。

根據下面列出的優勢,我們把水稻(栽培稻)胚乳作為生物反應器生產蝦青素。

●水稻是一種低成本、高收益、高安全的農作物；

●米飯很容易大規模種植，且產量很高；

●對蝦青素來說，水稻胚乳是很好的生物質容器；

●轉基因技術在水稻中的應用已經相當成熟；

●作為一種特殊的營養儲存器官，水稻種子方便存儲、提取和凈化；

●蝦青素在水稻種子中的積累不會中斷整個植物的正常生長；

BKY基因，編碼β-胡蘿蔔素酮酶，是蝦青素生物合成的關鍵基因，並不存在於大米和其他植物中。與此同時，在水稻胚乳中，大量的參與胡蘿蔔素合成的內源性基因的表達水平低或沒有表達。因此，不能在野生型水稻中生產蝦青素。而使用基因代謝工程導入蝦青素合成通路相關基因，則可能實現在水稻中合成蝦青素。

在這個項目中，我們組裝了四個蝦青素生物合成的基因並轉入水稻愈傷組織，所有的基因由四個不同的胚乳組織特異性啟動子驅動。這樣，水稻胚乳可以成為蝦青素的特殊容器，方便之後的存儲和提取。

思路設計

基因疊載入體

我們使用了TransGene Stacking II進行上述四個基因的組裝。該系統由一個基於可轉化人工染色體（TAC）的雙受體載體（pYLTAC380GW）和兩個供體載體（pYL322-d1 / pYL322-d2）組成。通過使用Cre / loxP重組系統和兩對loxP突變位點，交替使用兩個供體載體完成了多輪基因組裝，最終將多個基因按順序裝配到了TAC載體上。（圖3）

實驗設計

首先，對四個基因的核酸序列進行密碼子優化和並使其在水稻中直接穩定合成。然後，將這些基因亞克隆到兩個供體的胚乳特異性基因盒上。接下來，使用TransGene Stacking II系統將這些基因和無選擇標記元件組合到一個基於TAC的載體里。最後，把所獲得的多基因載體轉入根癌農桿菌EHA105中，用於水稻愈傷組織的轉化。轉化得到的轉基因植物使用了PCR、RT –PCR、qRT-PCR和高效液相色譜法進行鑒定。項目原理圖如圖4所示。

敲除選擇標記

我們使用Cre / loxP位點特異重組方法來敲除選擇標記(圖5)。為了敲除轉基因水稻中的選擇性耐葯基因，需要將一個敲除選擇標記的元件組裝到有四個基因的多基因載體上。該元件由HPT（潮黴素）耐葯基因表達盒和受花藥特異性啟動子調控的Cre基因表達盒組成，被放在了兩個loxP位點中間。當Cre基因在轉基因水稻的花藥中表達時，Cre酶就會將兩個loxP位點間的敲除選擇標記元件敲除。

實驗結果

我們成功完成了多基因載體系統的構建，並使用農桿菌介導法將其轉入水稻中，最終得到了可合成蝦青素的轉基因水稻。（圖6）

圖6 水稻中的農桿菌介導的轉化過程

重要意義

項目的最重要意義在於通過代謝工程的原理，引入合成、調控、運輸相關基因，構建了植物生物反應器系統，在水稻中合成蝦青素；利用這一系統和技術，還能生產其他各種天然化合物，尤其是珍稀化合物，如能抗瘧疾的青蒿素、能治療癌症的紫杉醇、高保健作用的人蔘皂苷等，解決原料的昂貴稀少，難於提取等問題。

這樣不僅能夠降低珍貴藥物的生產價格，還能為生產藥物提供可持續的工業原料，保護珍稀物種的過量挖掘採摘，從而造成的生物資源的滅絕和環境的破壞。

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