【iGEM】2016天津大學項目介紹

（首發於微信公共號：藍晶實驗室 BluephaLab 【iGEM】）

作者：2016 天津大學 iGEM隊伍

以Molecular Training為競賽主題，利用結構生物學、分子設計和生物技術手段對在細菌中發現的、具有降解PET塑料活性的酶（PETase）成功實施了多樣性的「馴化」，最終使該酶的催化能力提高了近400倍，極大地提高了該酶在環境保護中廣泛的應用前景。

解析PETase的結構

Molecular Training 有兩種方式，既可以通過「馴化」分子自身而使其獲得更優良的特性，也可以通過改變分子的環境使分子自我馴化從而提高分子的工作效率。

我們運用第一種方式，解析了PETase的結構，通過分子對接分析其結構找到其活性中心。我們模擬了20餘種training後的分子結構，選擇其中三個模擬效果最好的進行實際實驗，結果顯示，其中WARRIOR的催化能力是野生型的3倍。

「馴化」PETase

我們的目的是training molecules 從而使分子更高效的工作，因此我們需要為分子提供一個更好的環境，使分子可以自我馴化。通過表面展示系統，每個細菌的表面都錨定了大量的酶，也就是說酶的數量增加了。大家都知道，我們選擇的大腸桿菌每二十分鐘繁殖一代，所以我們的細菌更容易培養和儲存。

那麼，什麼是表面展示？ 細胞表面展示通過與錨定序列融合使得小肽和蛋白可以被展示在微生物的表面。

在我們的項目中，目的蛋白就是PETase，不同的錨定序列提供不同的環境。因為在實際實驗前，難以得知哪個錨定序列可以有效的展示，所以我們選擇了四種錨定序列進行實驗。

我們把錨定序列和PETase的基因通過overlap PCR融合在一起，然後將融合序列構建到Pet22b載體上，通過載體上的His-tag我們可以鑒定我們的蛋白是否表達。

首先，我們利用SDS-PAGE篩選出蛋白表達量最高的條件，並通過Western Blot 確定SDS-PAGE的條帶是我們的蛋白。然後，在免疫熒光的圖片中，我們看到了我們的PETase成功展示在了桿狀的大腸桿菌的表面。在酶活檢測中，利用大腸桿菌馴化的PETase酶活是野生型的近55倍。

這個結果給了我們啟迪：能否通過提供更好的環境來更好的training molecules？

這一次我們選擇了畢赤酵母，原因如下：第一，酵母是球形菌，意味著它的比表面積更大，能夠展示更多的PETase；第二，酵母細胞壁的組成成分與大腸桿菌大不相同；第三，我們可以把目的基因插入酵母的基因組中，而大腸桿菌只能通過質粒表達，因此，酵母的表達更加穩定。

我們通過分子克隆完成了質粒構建，然後基因序列線性化，整合進入酵母基因組，進行表達。之後我們篩選出陽性克隆，進行免疫熒光實驗，證明了目的蛋白確實展示在了酵母細胞壁上。隨後，取培養不同時間的菌進行酶活測定，得到提高了近200倍催化能力的表面展示PETase畢赤酵母。

至此，已經完成了對PETase的「馴化」。

共展示PETase和Janus

15年我隊憑藉參賽項目Janus，拿下金獎、兩個單項第一、一個提名獎的成績，Janus（疏水蛋白）也是已經「馴化」好的蛋白。因Janus能反轉酵母細胞表面性質，從親水變為疏水，所以我們推測，將兩種「馴化」完成的蛋白質共展示在畢赤酵母表面，Janus能幫助PETase吸附同樣疏水的PET膜，從而促進PET降解反應。

最終，我們得到了提高近400倍催化能力的共展示PETase和Janus畢赤酵母。

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