PCR反應中各種添加劑的作用

相信大家在做PCR反應時總能遇到這樣或是那樣的問題，但多數都可以歸為兩個主要問題：

1. 基因模板的擴增太少（amplification）;
2. 非目標基因擴增太多。

使用添加劑是解決這些問題的常用策略之一。通常添加劑的作用有兩方面：

1. 降低基因的二級結構（secondary structure）;
2. 降低非特異性的啟動（priming）。

今天小編就簡單給大家介紹一下PCR反應中常見的添加劑以及它們的作用。

降低二級結構的添加劑

二甲基亞碸（Dimethyl sulfoxide，DMSO）

DMSO可以降低DNA的二級結構，所以通常在擴增GC含量很高的基因樣本的時候都會添加。但是，DMSO 也會大大降低Taq 聚合酶（Taq polymerase）的活性（activity）。所以，大家要權衡好模板的接近率（template accessibility）和聚合酶的活性。小編建議大家可以嘗試不同的DSMO的濃度，例如從2% 到10%，來找出適合自己實驗的濃度。

非離子性洗滌劑（Non-ionic detergents）

非離子性洗滌劑，例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40，通常可以降低DNA二級結構。雖然這樣可以增加模板基因的擴增，但也會帶來非特異性擴增的困擾。所以，這些添加劑對無雜物低產量的PCR反應很管用，但對相對不太純的PRC反應就沒那麼好了。非離子性洗滌劑的另外一個好處就是可以減少SDS 污染。通常在DNA提取過程中，SDS會被帶到PCR這個步驟，這就大大抑制了聚合酶的活性。所以，反應中加入0.5% 的Tween-20 或是Tween -40 可以中和SDS帶來的負面影響。

甜菜鹼（Betaine）

甜菜鹼可以通過減小二級結構的形成來提高DNA的擴增，並且一般是商用PCR kit的「神秘」添加物。如果大家要用甜菜鹼的話，應該放甜菜鹼或是一水甜菜鹼（Betaine or Betaine mono-hydrate），但不是鹽酸甜菜鹼（Betaine HCl）, 調成最終濃度為1-1.7M 的濃度。甜菜鹼還可以幫助提高特異性，因為它能消除DNA融化/變性時對鹼基對的依賴（eliminate the base pair composition dependence of DNA melting/DNA denaturation） 。

降低非特異性啟動的添加劑

甲醯胺（Formamide）

甲醯胺是一種常用的有機PCR添加劑。它可以和DNA中的大溝（major groove）和小溝（minor groove）相結合，從而降低母版DNA雙螺旋的穩定性並且減低DNA的解鏈溫度（melting temperature）。甲醯胺在PCR實驗中使用的濃度通常在1%-5%。

四甲基氯化銨（Tetramethyl ammonium chloride，TMAC）

四甲基氯化銨可以增加雜化的特異性（hybridization specificity）並且提高DNA的解鏈溫度。因此，TMAC 可以去除非特異性的啟動，並且減少DNA和RNA的錯誤結合。如果大家在PCR反應中使用簡併引物（degenerate primers）時，記得可以添加TMAC，它常用的使用濃度為15-100mM。

其他常見的添加劑

除了以上提到的兩大類添加劑，PCR反應中還有許多常見的添加劑，雖然作用不同，但也至關重要。

鎂離子（Magnesium ion）

鎂離子是聚合酶不可缺少的一個輔因子（cofactor），也就是說如果沒有鎂離子的話，聚合酶是沒有活性的。但是，過多的鎂離子同樣也會影響聚合酶的工作效率。每種PCR反應中鎂離子的濃度都不盡相同。螯合劑（Chelating agents，例如EDTA 或是 citrate）, dNTP 的濃度和蛋白質都會影響鎂離子的濃度。所以，如果你的PCR實驗有問題，可以嘗試改變不同的鎂離子濃度，例如從1.0到4.0mM，中間間隔 0.5–1mM 就可以。

值得注意的是，多次凍融循環能夠導致氯化鎂溶液（magnesium chloride）的濃度分層。所以大家在每次使用之前一定要完全溶解，並且混合均勻之後再使用。

牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）

在分子化學實驗中，牛血清白蛋白是很常見的添加劑，尤其在限制酶酶切和PCR的實驗中。在PCR反應中，BSA 對於減少污染物，例如酚類化合物（phenolic compounds）有一定幫助。而且也有說法是它能減少反應物附著在試管壁的情況。在PCR反應中，通常BSA添加的濃度可達到0.8 mg/ml。