突發奇想：用蛇的基因替換老鼠基因為哪般？

來源：Pixabay

撰文 | 湯 波

責編 | 陳曉雪

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2016年10月20日，美國《細胞》（Cell）雜誌刊登一篇有趣的故事，美國勞倫斯伯克利國家實驗室的科學家在研究蛇的進化過程中，突發奇想地用蛇的一段DNA將小鼠的同源DNA進行替換，結果小鼠的四肢明顯變短，似乎像蛇一樣不長腿了。原來，蛇的祖先是有四肢的，在進化過程中由於這段DNA功能發生變化，導致四肢慢慢消失了。

「畫蛇添足」並非多餘

全球現存蛇的種類多達3000多種，雖然與蜥蜴等同屬爬行動物，但是卻看不到四肢，主要靠腹部的鱗片「滑行」。大多數人都把蛇看成是無腿的爬行動物，以至於中國歷史名著《戰國策》中那位「畫蛇添足」的仁兄，因為給蛇畫上了腿，既沒有喝到酒，更被後人恥笑了兩千年。不過最新考古發現，蛇也曾長過腿，而且還長了四條腿。

2015年7月24日的美國《科學》（Science）雜誌公布了一項驚人的考古新發現，英國朴茨茅斯大學的戴夫·馬蒂爾（Dave Martill）博士在一家德國索倫霍芬博物館裡參觀時，意外地發現一塊在巴西出土、距今已有1.1億年的白堊紀化石上，竟然有一條長有四條腿的蛇。通過仔細分析和比對，馬蒂爾博士等人認為這塊化石的確是蛇類化石，而非蜥蜴的，因為這個化石上的動物身體修長，有類似蛇的牙齒和一排用於爬行的腹鱗。

這條已沉睡上億年的古蛇標本被從巴西挖掘後，輾轉來到德國索倫霍芬博物館，只是作為白堊紀大型化石展的一個普通化石進行展覽，很長時間並沒有引起人們的注意，直到馬蒂爾博士發現了它。或許是因為它太小了，這條古蛇的體長僅為20厘米，研究人員推測它應該是條幼蛇，它的前腿只有約1厘米長，而後腿則稍微大一些，而且四肢均有明顯的五指，可能便於抓捕獵物或者輔助交配。

蛇起源於一種已滅絕蜥蜴的假說，之前已被多個只有兩隻後腿的蛇化石標本所證實，不過一直缺少四腳蛇化石的直接證據，因此馬蒂爾博士等人的發現正好填補了這一空缺。在這些只有後腿的蛇化石考古發現中，大多數研究都將蛇的祖先指向海洋蜥蜴——滄龍，一種與恐龍同時代、並同恐龍一起滅絕的海洋大型生物。不過，根據這條四腳蛇的頭蓋骨和身體的比例，以及缺乏像大多數海洋動物一樣扁平的尾巴等特徵，馬蒂爾博士等人推測這種蛇是由陸地上的掘穴蜥蜴而非海洋蜥蜴進化。

?長有四肢的蛇化石、前腿和後腿及復原圖（源自Life Science網站）

一小段DNA在作怪

考古學家們為大家描繪出一幅較為完整的蛇類進化圖：大約1.1億年前，掘穴蜥蜴進化成擁有四隻腳的蛇，大約9500萬年前，由於腿腳在蛇的爬行運動中失去用處，而且變得礙事，蛇的前腿逐漸退化，不久蛇的後腿也隨之退化了，現存的某些大蟒蛇還保留有後腿的痕迹。

但是，蛇的腿為什麼會退化呢？最近，一些分子生物學家找到了另外的答案。為了弄明白蛇的四肢退化原因，美國勞倫斯伯克利國家實驗室阿卡索·維瑟爾（Axel Visel）教授領導的研究小組將目光聚焦在一個叫音蝟基因（Sonic hedgehog gene）的遠距離增強子ZRS上。

音蝟基因是胚胎髮育一種非常重要的基因，對胚胎體節發育和肢芽形成起著重要作用。音蝟基因首先在果蠅身上被發現，因該基因突變的果蠅胚胎呈多毛團狀，酷似受驚刺蝟而得名，幾乎存在於所有動物和人。而ZRS增強子位於音蝟基因的上游約100萬個鹼基對的位置，對脊椎動物四肢發育至關重要。一旦這個增強子序列發生突變，可能導致動物的四肢發育異常，其中一些突變導致了人的多指症。

研究人員分析了6種蛇類的ZRS增強子序列，包括緬甸蟒蛇、紅尾蚺、扁頸眼鏡蛇、斑點響尾蛇、極北蝰和玉米蛇，分別代表蛇類進化過程中的不同形態階段，其中前兩種蛇還保留有後肢殘跡，後四種蛇的四肢則完全退化。在將這些序列與人、小鼠、牛、海豚、象鼻鯊、雞、蝙蝠、蜥蜴和腔棘魚等其它16個物種的同源序列進行比對後，研究人員驚奇地發現這6種代表性蛇類的ZRS增強子均缺失了一段17個鹼基對序列，其中玉米蛇的ZRS增強子序列則全部缺失，這也是ZRS增強子區域內唯一的一段在所有蛇類全部缺失，而在蜥蜴和魚類等其它物種中都高度保守的序列，因此推測其與蛇的四肢退化有關。

為了進一步研究這些增強子ZRS缺失序列的功能，維瑟爾教授研究小組利用CRISPR/Cas9這一最新的基因組編輯技術，將小鼠增強子ZRS序列替換成其它物種的同源序列，包括人和腔棘魚的序列。在這些基因序列被替換的小鼠胚胎中，研究人員觀察到，替換成眼鏡蛇ZRS序列的小鼠完全檢測不到音蝟基因的表達，蟒蛇ZRS序列替換小鼠則只有極其微弱的表達，但是這些小鼠的四肢均顯著縮短，而且成年後四肢也沒有能長出，而其它物種的ZRS序列均沒有影響小鼠的四肢發育，就連本身不長腿的海豚、鯊魚和腔棘魚等魚類ZRS序列也沒有蛇類ZRS序列的威力，序列替換後小鼠的四肢也發育正常。

?被蛇的增強子ZRS序列替換後，小鼠四肢發育不全（EZ Kvon et al., 2016)

顯然，缺失17個鹼基對序列的音蝟基因增強子ZRS越來越像是蛇類四肢退化的「罪魁禍首」了，這一進化史上的懸案似乎結案了，但是維瑟爾教授研究小組研究得正起勁，完全沒有停下來的意思，很快，他們又將這一段缺失序列補回到蟒蛇的增強子ZRS上，同樣採用CRISPR/Cas9技術，將該重構的蟒蛇ZRS序列替換掉小鼠的同源序列，結果小鼠的四肢發育完全正常，進一步證實了蛇類音蝟基因增強子ZRS的17個鹼基對序列缺失是蛇類四肢退化的主要原因。

不過維瑟爾教授研究小組讓小鼠來驗證增強子ZRS的功能並非首創，應該是受日本科學家的啟發。早在2005年，日本國家遺傳學研究所Tomoko Sagai等人將小鼠的音蝟基因增強子ZRS全部刪除，得到的小鼠四肢也大大縮短，第一次利用基因工程小鼠模型證明了增強子ZRS對動物四肢發育至關重要的作用。維瑟爾教授研究小組發現完全缺失增強子ZRS序列的玉米蛇也正與這一研究結果相吻合。

?ZRS序列刪除的小鼠四肢也表現出發育不全（Tomoko Sagai et al., 2005)

蛇的四肢能回來嗎？

也可能有人會腦洞大開，如果用蜥蜴的ZRS序列將蛇的同源序列替換掉，會不會培育出擁有四隻腳的蛇呢？正如維瑟爾教授研究小組2016年10月20日在美國《細胞》雜誌上論文所聲稱的那樣，他們並不希望製造出這種四腳蛇，而且可能還存在其它的基因或調控序列對動物四肢的發育起到一些重要作用。

幾乎就在維瑟爾教授研究小組發表論文的同時，美國霍華德·休斯醫學研究所的弗朗西絲卡·利爾（Francisca Leal）和馬丁·科恩（Martin Cohn）也在《當代生物學》（Current Biology）發表論文，公布了他們所發現的蟒蛇後肢並沒有完全退化的秘密，同樣也涉及音蝟基因調控四肢發育的特異增強子ZRS突變，除了維瑟爾教授研究小組發現的那個缺失片段，他們還發現了該增強子的另外兩段缺失序列都可能也與蟒蛇後肢並沒有完全退化有關，而這三段缺失的序列共同作用，使得蟒蛇的ZRS增強效應減弱了近90%。他們進一步的研究認為，這三段缺失的序列原本正好是音蝟基因一些轉錄因子的結合位點，蟒蛇的序列缺失讓這些轉錄因子無法正常工作，使得音蝟基因表達水平大幅減弱，最終導致蟒蛇前肢完全退化，後肢部分退化。

弗朗西絲卡·利爾和馬丁·科恩在驗證其突變序列的功能時，同樣藉助於基因工程小鼠。他們將蟒蛇和蜥蜴的增強子ZRS序列分別與一種報告基因——LacZ基因構建成一個新基因，分別顯微注射到小鼠受精卵，培育出11.5天的轉基因小鼠胚胎。通過染色，LacZ基因產物會呈藍色，可以通過藍色深淺直觀地判斷LacZ基因表達水平的高低，結果含蜥蜴增強子序列的小鼠胚胎前後肢報告基因均有較強的表達，而含蟒蛇增強子序列的小鼠胚胎前後肢報告基因則只有很微弱的表達，表明缺失了三段序列的蟒蛇ZRS增強子的確與其四肢退化有關。不過該研究並沒有對小鼠四肢發育進行後續研究，也沒有培育出維瑟爾教授研究小組那樣活的轉基因小鼠，無法從轉基因小鼠四肢骨骼發育形態進一步確證這些突變序列的功能。

作者簡介

參考文獻：

1.Evgeny Z. Kvon, Olga K. Kamneva, Uirá S. Melo, Iros Barozzi, Marco Osterwalder et al,.Progressive Loss of Function in a Limb Enhancer during Snake Evolution. Cell. 2016,167(3):633-642.

2.Martill, D. M., Tischlinger, H. & Longrich, N. R. A four-legged snake from the Early Cretaceous of Gondwana. Science, 2015. 349, 416–419.

3.Leal, F. & Cohn, M. J. Loss and re-emergence of legs in snakes by modular evolution of sonic hedgehog and HOXD enhancers. Curr Biol. 2016:26(21),2966-2973.

4.Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M. & Shiroishi, T. Elimination of a long-rangecis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 2005,132: 797–803.

製版編輯：姚蘭婷丨

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