【重磅推薦】借來的上帝之手——CRISPR/Cas9基因編輯系統 | 原創
撰文 | 李玉琛
責編 | 周宇祥
編者按：如果基因可以像搭積木一樣隨意，你想要做些什麼？別想啦，你以為CRISPR/Cas9可以讓你真成為上帝啊！可你也別小瞧了CRISPR/Cas9,說的沒錯，它正在改變世界——讓那些一直高懸於人類頭頂的疾病落荒而逃。
一. CRISPR/Cas9從哪裡來
生物技術的變革往往令人意想不到。繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出以後，CRISPR/Cas9橫空出世，成為了當今最主流的基因編輯系統。從科學界首次報道了CRISPR成簇迴文重複序列的1987年至今已經過去三十年，而CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術在最近的5年里才真正在生命科學領域大放異彩。特別要提到2012年兩位女科學家Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier首次發現了在細菌適應性免疫系統中由Cas蛋白介導的核酸內切酶作用（如圖1），兩人因此也獲得了2015年生命科學突破獎。從那以後最新一代基因編輯技術才真正應用到生命科學的各個領域，並迅速崛起引發生物醫學領域新的革命。
二. 揭下CRISPR/Cas9的神秘面紗
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein）由兩部分構成：規律成簇的短間隔重複（CRISPR）和CRISPR相關蛋白（Cas）總稱為常間迴文重複序列叢集蛋白系統。其發揮作用還需要gRNA（guide RNA）和基因序列上的PAM結構指引Cas蛋白髮揮核酸內切酶作用。在基因層面CRISPR位點主要由Cas基因，前導區域，CRISPR序列構成（如圖2） 。其轉錄出的crRNA可以靶向Cas蛋白實施切割作用。
在與病毒的鬥爭中，細菌和古細菌進化出了複雜的CRISPR適應性免疫武器，這一武器可以分為三型。而二型CRISPR系統由於操作簡便（只需sgRNA和Cas9蛋白）、效率高而被廣泛應用。三種類型的CRISPR系統儘管有所不同，但都是通過三個主要過程完成其功能：
1.外源非宿主DNA的採集
病毒噬菌體等短片段DNA（protospacers）可作為原間隔序列插入到宿主CRISPR位點中，由相應的重複序列隔開。其中protospacers兩側的PAM序列（前間隔序列臨近基序）也被整合進CRISPR位點中。
2.crRNA的合成
整合後的CRISPR系統轉錄生成初級產物pre-crRNA,經加工後形成一組短小的crRNAs，這些crRNA都包含著外源DNA的對應序列。在二型系統中反式作用crRNA（tracrRNA）可以與crRNA形成互補結構，對crRNA的加工成熟起著重要的作用。
3.CRISPR的靶向干擾
當外源DNA再次侵入時，通過掃描外源protospacers 旁的PAM，成熟的crRNA可以指引Cas蛋白靶向互補DNA。目標序列由專門的Cas核酸內切酶切割，達到基因編輯的目的。
總結一下CRISPR的原理： 細菌利用一小段RNA（gRNA）引導具有內切酶活性的蛋白(Cas9)識別並剪切外來DNA，達到降解外源DNA實現適應性免疫的目的（如圖3）。在化膿性鏈球菌中發現的Cas蛋白（Cas9）是目前應用最廣泛的Cas蛋白。上個月發表在cell上的一篇綜述，詳細地列舉了可以用於哺乳動物細胞基因組編輯的多種Cas9酶（如圖4）。
CRISPR/Cas9對靶片段進行剪切後產生基因片段的缺失。此時，細胞內的修復系統就會被激活。下面是見證奇蹟的時刻（如圖5），修復系統可以進行同源介導修復（HDR）或者非同源末端連接（HEJ）。利用HDR這一途徑可以替換活細胞中部分基因組（knock in），這似乎就是人類夢寐以求的。當然要想實現這一基因編輯策略，外源的DNA必須與靶DNA有較高的同源性。而當非同源末端連接（NHEJ）發生在雙鏈切除的位置，雙鏈切除部位會進行隨機插入或缺失。
圖5.基因的修復系統
雖然CRISPR/Cas9有著高效的基因編輯能力，但如何控制其對基因組的修改以及減少編輯過程中不良事件的發生，是該項技術需要完善和突破的地方。最新研究表明自然界中存在Cas9的抑制，科學家們找到了特異性抑制腦膜炎奈瑟菌CRISPR/Cas9系統的抑制性蛋白。這些anti-CRISPR可作為真核細胞基因編輯的有效抑製劑（如圖6）。
除此之外科學家們還創造了一種更為高效可控的CRISPR基因組編輯平台——sOPTiKO（如圖7）。可以對發育過程中的細胞實施knock out以及konck down，從而觀察任何發育階段基因的沉默和關閉。
年輕華裔科學家張峰（想膜男神的夥伴可以自行去Google scholar搜索)課題組的最新的一項研究中，研究者發現了一種依賴於sgRNA介導的ssRNA編輯系統（LshC2c2）（如圖8）。和以往的靶向DNA的編輯系統完全不同，此種基於CRISPR 的RNA靶向技術可以僅僅在RNA層面調控基因的表達，而對細胞基因組很「溫柔」，並不造成永久性「傷害」。這也為RNA的研究尤其是非編碼RNA的研究提供了重要的突破口(Abudayyeh et al., 2016)。
圖8.LshC2c2編輯系統
另外該課題組還在土拉熱弗朗西斯菌中發現了一種Cas9酶的潛在替代者Cpf-1。不需要核酸核酶也不需要tracrRNA ,該酶就可以以一人之力對pre-crRNA進行加工。更為重要的是其可以對DNA和RNA進行雙重切割，還可以同時編輯多種靶點。毫無疑問，Cpf-1這個新人有望成為替代Cas9的一種新型切割工具酶(Zetsche et al., 2016)。
三.CRISPR/Cas9到哪裡去
隨著該項技術的發展，以CRISPR/Cas9為基礎的基因編輯技術在基因治療相關領域展示出極大的潛力，如惡性腫瘤、艾滋病以及其他多種遺傳性疾病的基因治療。下面總結基於CRISPR技術實施基因治療的最新研究進展。
1. 肺癌還會是死亡的代名詞嗎？
中國華西醫學院研究團隊從患者血液中分離出免疫細胞，然後利用CRISPR技術敲除PD-1蛋白基因，此蛋白可降低免疫系統對腫瘤細胞的殺傷作用。讓PD-1失去功能從而增強免疫系統對腫瘤的抵抗能力。目前該項試驗是否有效果還有待觀察(Cyranoski, 2016)。
2. 細胞的命運我做主
早在2006年日本京都大學醫學院山中伸彌教授就發現成年或胚胎小鼠成纖維細胞可以經轉化產生能夠分化為任何一種細胞類型的幹細胞（IPS細胞）。這也使得他在短短六年之後獲得諾貝爾獎。
圖9.成纖維細胞轉化為誘導神經元細胞
最新的一項研究中，科學家運用dCas9介導的轉錄激活因子對特定基因組實施了表觀遺傳學修飾。經過修飾，成纖維細胞內可表達特定細胞的轉錄拷貝得到激活，近而將小鼠成纖維細胞轉化為神經元細胞（如圖9）(Black et al., 2016)。
3. 哪怕是一個鹼基我也能改過來
人體的大多數遺傳病本質上都是由於鹼基的置換和突變導致的，而之前的基因編輯技術卻不能對這些點突變進行高效的校正。最新的一項研究中，研究人員將胞嘧啶脫氨基酶與dCas9聯結形成一種新型鹼基編輯系統（如圖10）。在小鼠和人細胞系中，運用此種方法可以將胞嘧啶轉變為尿嘧啶，並有可觀的有效率和低錯誤發生率。可以說，此項研究為治療單鹼基遺傳病提供了廣闊的前景。(Komor et al., 2016)。
4. HIV你別跑啊
HIV作為一種逆轉錄病毒，可以將其自身的RNA逆轉錄為DNA並插入到宿主細胞基因組以擴增新的遺傳物質和病毒。他總是和我們的CD4+T細胞很是親近，在茫茫人海尋找他的愛人，愛深了，就想著帶她殉情，哈哈，可是我們的免疫系統就倒霉了。當敵人群起而攻，免疫系統人員不足，招架不住，生命隨之消逝。不用擔心，最新的一項研究中，研究人員利用CRISPR技術在小鼠細胞基因組中成功切除一段HIV-1 DNA序列，並且這種切除效應可在多種組織內存在（如圖11）。這一研究成果可以讓我們直面HIV病毒複製的源頭—記憶T細胞基因組上的HIV DNA片段——然後狠狠得來上一拳。我們不難想像，此項技術若能聯合使用抗逆轉錄病毒藥物，必將給艾滋病的治療帶來顛覆性的改變，或許某一天我們可以對艾滋病say goodby啦。(Kaminski et al., 2016)。
5.豬和人類將更加親密
我們都知道轉錄因子Oct4在維持細胞乾性中發揮重要作用，但是我們如何知道細胞是否已經表達了Oct4？研究人員通過CRISPR/Cas9介導的基因敲入技術，製備了攜帶有Oct4-td tomato的報告基因敲入豬。在目標位點2A-td-Tomato取代了Oct4的終止密碼子（如圖12），所以熒光能夠準確反應Oct4基因的表達情況。老師再也不用擔心我們的細胞沒有表達Oct4了。(Lai et al., 2016)。
對於實施豬器官移植目前面臨的主要問題，是如何減少免疫排斥反應以及豬供體器官內源性免疫病毒（PERV）的產生。最新一項研究中，科研工作者們利用CRISPR技術讓豬胚胎中的62個豬內源性免疫病毒基因陷入永久的沉睡，從而使豬供體器官（心臟瓣膜，肝臟）在人體中的移植提供了可能性(Yang et al., 2015)。
7. 給艱難梭君的逐客令
艱難梭君可是醫院感染的的頭號危險分子。這位臭名昭著的罪犯可以在住院患者體內長期非法定居，一有機會就想搞個大新聞——致死性的腹瀉和腸道炎症。來自波士頓兒童醫院的研究小組通過CRISPR技術在體外培養的人體細胞引入突變，並進行全基因組篩選，發現編碼Frizzled受體的基因被刪除時，腸道器官會對艱難梭菌毒素產生抗性，之後的動物實驗同樣也獲得陽性結果。原來罪犯是這樣入侵的，我們人類可不會再給你機會啦。(Tao et al., 2016)。
後記：目前，CRISPR/Cas9已經成為科研人員研究生命系統和人類疾病的強有力工具。我們有充分的理由相信，在不遠的將來，新的CRISPR系統可以有效治療人類的遺傳疾病。劍有雙刃技術也一樣，像CRISPR/Cas9這種可以編輯基因的技術已經不能用危險來形容。我們人類在揮劍殺敵的時候，一定要時刻警惕潛在的危機，完善相關法律法規應該是當務之急。
References
[1]. Abudayyeh, O.O., et al., C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science, 2016. 353(6299): p. aaf5573.
[2]. Zetsche, B., et al., Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol, 2016.
[3]. Cyranoski, D., CRISPR gene-editing tested in a person for the first time. Nature, 2016. 539(7630): p. 479.
[4]. Black, J.B., et al., Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell Stem Cell, 2016. 19(3): p. 406-14.
[5]. Komor, A.C., et al., Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016. 533(7603): p. 420-4.
[6]. Kaminski, R., et al., Excision of HIV-1 DNA by gene editing: a proof-of-concept in vivo study. Gene Ther, 2016. 23(8-9): p. 690-5.
[7]. Lai, S., et al., Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering. PLoS One, 2016. 11(1): p. e0146562.
[8]. Tao, L., et al. Frizzled proteins are colonic epithelial receptors for C. difficile toxin B. NATURE，2016. 538, 350-355.
歡迎感興趣的小夥伴加入我們的公眾號團隊，只要你有想法、有熱情，就能在這裡得到鍛煉和成長。請聯繫：fanyushuaishuai（wechat。
歡迎關注同名微信公眾號 象物 ID:xiangwu_world。
聯繫我們：fanyushuaishuai轉載授權：13462749888@163.com推薦閱讀：
※未來小編不僅編文還能編人,人類將不只一個爸媽！
※基因編輯技術被用來治療病患；美國新法案對學生課以重稅 | 每周播報
※什麼是基因編輯？
※中科院神經所在世界上首次獲得基因敲入的食蟹猴的研究有何突破？基因敲入相比於基因敲除有哪些難點？
※NgAgo-gDNA 這一技術如果被廣泛證明有效，可以突破目前基因編輯上的哪些瓶頸？