又見張鋒：基因修飾技術再現新突破

張鋒。 圖片來源: Stan Grazier

編者按：

「基因編輯技術領域的進展太快，感覺比現實中的時間要快數倍。」加州大學戴維斯分校的細胞生物學家Paul S. Knoepfler在《紐約時報》6月3日發表的報道中表示。此言不虛。上個月，河北科技大學的韓春雨剛剛顯著推進了編輯DNA的基因修飾技術：NgAgo。6月2日，華人科學家張鋒又宣布發現了一種編輯RNA的基因編輯工具CRISPR-C2c2，他表示，「 C2c2是『CRISPR工具箱』研發中的里程碑。」「C2c2的應用前景具有多種可能性，我們很高興可以為生物醫學研究提供這一類工具」。

撰文 | 玉寶

責編 | 王承志 陳曉雪

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CRISPR-Cas系統用來編輯DNA的技術已非常成熟，成為全世界各大實驗室的主流基因編輯工具。最近，麻省理工學院博德研究所的核心研究員張鋒和其合作者證實，CRISPR也可以用來編輯RNA。

6月2日，《科學》（Science）雜誌在線發文，報道了張鋒等人在CRISPR-C2c2這一RNA介導的RNA編輯系統方面的研究成果。

CRISPR-C2c2系統能夠根據靶向序列特異地編輯單鏈RNA。C2c2，全稱為Class 2 type VI-A CRISPR-Cas effector，同家族的Cpf1 (18), C2c1, and C2c3並無編輯RNA的功能。2015年12月，張鋒曾經在《分子細胞》(Molecular Cell)發文，系統梳理過C2c2等四個核酸酶的功能。

CRISPR是一種半數細菌都具有的免疫系統。細菌可以藉此抵禦噬菌體和其它微生物的攻擊。學界使用廣泛的CRISPR-Cas9是專門靶向DNA的基因編輯系統。目前CRISPR領域的研究主要聚焦於改進編輯DNA的Cas9系統，研究RNA編輯系統的實驗室比較少。

C2c2是第一個被發現的靶向RNA的CRISPR系統，2015年10月張鋒團隊即發現了這個特異的系統。C2c2來自一種纖毛菌 Leptotrichia shahii，含有HEPN結構域。該結構域只存在於RNA酶中。這使研究人員猜測C2c2也具有RNA酶活性。他們在大腸桿菌中證明了這一點。

首先，他們將C2c2和針對某種RNA的噬菌體特異的間隔序列導入大腸桿菌中，然後用這種噬菌體感染細菌。噬菌體是一種可以感染並殺死細菌的病毒。實驗發現，細菌可以良好地生長，這說明噬菌體的RNA被降解了。如果將間隔序列換成了別的序列，則細菌會被噬菌體感染而無法正常生長。如果將C2c2的HEPN結構域中關鍵的區域突變掉，會使細菌喪失對噬菌體的抵抗性。體外的生化實驗也表明C2c2具有RNA酶活性，而且依賴於HEPN結構域。

C2c2的RNA酶的關鍵位點已經被找到，其引導RNA的結構也可以被設計。這使得C2c2可以被改造成良好的RNA編輯工具。例如，將其酶活性位點突變後，C2c2可以結合特定RNA而不能切割它，這可以使研究人員可以方便地使用熒游標記想要研究的RNA。並且C2c2系統具有高通量的特點，可以更廣泛地用於基礎研究，並推動對人類複雜性狀疾病的發病機制研究。

C2c2這個RNA酶的發現，開拓了CRISPR系統的應用範圍。它可以用來標記、修飾、和剪切細胞中的RNA。經過一系列實驗，張鋒團隊證明 C2c2可以剪切單鏈RNA，並且可以直接在細菌活體內做剪切；但C2c2剪切不了雙鏈RNA。

研究人員還發現了C2c2另外一個有趣的特性：當其將靶序列剪切後，它對非靶序列的其它RNA序列也有一定的降解功能。敏銳的研究人員發現了這一點後，認為細菌可能存在不同於CRISPR系統的RNA免疫系統。這是下一步研究的方向和重點。而對於需要精確編輯RNA的工具來說，這個特性未來需要被克服。

基因敲降（gene knockdown）工具當中，目前應用最廣泛的是RNA干擾技術。未來該技術有可能被C2c2這類RNA編輯系統取代。C2c2系統具有更高的特異性和敲降效率。它具有兩個主要優勢：

1. C2c2是一個2元件組成的CRISPR系統，只需要設計起引導作用的RNA序列即可。

2. C2c2基因本身可以被轉錄和翻譯，預示著細胞或細菌中可以做C2c2基因的轉基因。

目前CRISPR基因編輯工具越來越完善和齊全了。CRISPR-Cas9對細胞中基因組的遺傳改變可以永久性的，而CRISPR- C2c2卻可以臨時改變相應基因的調控和表達。C2c2系統由於需要28nt的序列做引導，比前者具有更高的特異性；同時，C2c2系統具有更多的基因編輯功能，可以操縱RNA的功能和翻譯，也可以用於高通量篩選，製作生物晶元等。

「 C2c2是『CRISPR工具箱』研發中的里程碑」，在麻省理工學院的新聞中，張鋒自我評價道，「C2c2的應用前景具有多種可能性，我們很高興可以為生物醫學研究提供這一類工具」。值得期待的是，C2c2這個工具的發現，將有助於生物學家研究RNA在細胞中的精細功能，也有助於人類疾病發病機理的研究。

參考文獻：

1.O.O. Abudayyeh et al., 「C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector,」 Science, doi:10.1126/science.aaf5573, 2016.

2.Broad Institute. 「New CRISPR system for targeting RNA」 ，June 2, 2016

New CRISPR system for targeting RNA

3.Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems

Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems: Molecular Cell

4.Scientists Find Form of Crispr Gene Editing With New Capabilities，http://www.nytimes.com/2016/06/04/science/rna-c2c2-gene-editing-dna-crispr.html?_r=1

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