探索微觀世界的神器——超分辨顯微成像技術

01-28

出品：科普中國

製作：中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所

監製：中國科學院計算機網路信息中心

引言：2014年的諾貝爾化學獎頒給了三位科學家：EricBetzig、StefanW.Hell和WilliamE.Moerner，以表彰他們在超分辨熒光顯微鏡領域做出的貢獻。超分辨熒光顯微技術在生命科學領域具有重要意義，但超分辨有什麼優點，起到什麼作用，怎樣實現超分辨？這些問題，讓我們來為大家一一解答。

圖1 2014年諾貝爾化學獎得主
圖片來源：Nobelprize.org

一沙一世界，一花一菩提——生命科學都做些什麼

每個生物個體都是一個複雜的系統，以身高170厘米的小明為例，他的手部表面覆蓋著皮膚（組織），皮膚由細胞組成，細胞內含有細胞核（細胞器），細胞核的核仁里含有遺傳物質DNA（分子），分子是化學過程和生命過程的最小單元。生命科學從微觀層面觀察生命過程，大到組織和細胞，小到蛋白質、DNA、RNA等化學物質，通過研究它們在生命過程中的變化，揭示生命的物質基礎和基本現象。從尺度上來說，組成小明身體的細胞平均尺寸大約幾十微米，而最大的分子——蛋白質的尺寸只有幾十納米，相當於他身高的1/10^7。

孔子告訴我們，工欲善其事，必先利其器。細胞和分子這麼小，想要看到它們，需要顯微成像技術的幫助。

圖2 將人放大數百萬倍，「看到」另一個精彩的世界
圖片來源：維基百科

盲人摸象與隔岸觀火——原子力探針顯微與光學探針顯微

顧名思義，顯微成像是一種觀察微小物體的手段。原子力探針和光學探針是兩種常用的顯微技術，前者就像盲人摸象，利用一個微小的探針接近樣品，通過反饋的作用力來實現觀測，這種觸摸的方式只能探測樣品表面，還會對脆弱的樣品造成損傷，不適用於觀察生命過程；相比之下，光學探針顯微就像隔岸觀火，把探測用的光束打到物體上，通過收集透射或者反射光的方式來進行觀測，對樣品的影響很小。

圖3 兩種常見的顯微鏡
圖片來源：維基百科

為了提高光學顯微的成像效果，以便從複雜的細胞組織中提取出自己想要的細節，科學家還採用了熒游標記的方法，在細胞中加入特殊的熒游標記物，這些標記物在特定的光照下，有的發出紅光，有的發出綠光，而且每種熒游標記物都具有一定的選擇性，只與細胞中既有的特定分子結合，然後發出熒光。熒光成像大大提高了光學顯微成像的對比度，還幫助科學家分辨細胞中的不同結構。圖中所示是牛肺動脈內皮細胞，細胞核呈現藍色，線粒體呈現紅色，微絲呈現綠色。然而光學顯微也有自己的缺陷——就像用望遠鏡看天上的星星，即使再先進的、口徑再大的望遠鏡，也沒法看清所有星星；顯微成像的分辨能力也受到光學成像系統的限制，這種限制來自於光的衍射，因此被稱作衍射極限。

圖4牛肺動脈內皮細胞
圖片來源：維基百科

墓碑上的公式——衍射極限

波動性是光的基本特性之一，由此產生的衍射效應始終困擾著包括顯微、望遠在內的光學成像系統。德國物理學家ErnstAbbe發現了顯微鏡的衍射極限，並將公式刻在自己的墓碑上。這裡我們不去詳細分析衍射極限的成因，只需要大家知道這樣一個結論：由於衍射極限的存在，顯微成像系統的照明光只能在樣品上形成有限小的圓形光斑，被稱作艾里斑；同樣地，樣品上的分子只能在成像相機上形成有限小的圓斑。從成像的角度來說，衍射極限影響下的顯微成像系統只能分辨有限小的細節，一般在200納米到300納米之間。

前面已經說過，細胞的直徑大約幾十微米，想要研究細胞內的生命過程，至少要能看清細胞器才行。傳統光學顯微鏡的解析度用來看細胞還馬馬虎虎，對細胞器就只能看個大概，沒法滿足生命科學研究的需求。近年來，科學家們從不同的角度入手，實現突破衍射極限的光學顯微成像，也就是文章開頭提到的超分辨熒光顯微鏡。超分辨的實現途徑很多，有結構光照明（SIM）、受激發射損耗（STED）、光激活定位顯微（PALM）、隨機光學重構（STORM）等，限於篇幅我們只講獲得諾貝爾獎的兩種——StefanW.Hell的受激發射損耗（STED）和EricBetzig、WilliamE.Moerner的光激活定位顯微技術（PALM）。

圖5 衍射極限限制了顯微鏡的分辨能力
圖片來源：維基百科、果殼網

管中亦可窺豹——受激發射損耗顯微鏡

傳統光學顯微鏡採用寬場成像的方式，照明光一次照亮整個成像範圍，然後用相機對整個成像範圍進行曝光成像，一次獲得整幅圖像。「管中窺豹」型的掃描成像則有所不同，照明光聚焦在樣品上，形成一個極小的光點——也就是所謂的「管」，每次只對光點對應的區域進行成像；當我們改變光點的位置，使它依次掃遍整個樣品，也就獲得了一幅完整的圖像。有人要問了，即使採用「管中窺豹」的方式，每次聚焦的光點依然受到衍射極限限制，系統分辨能力比起所謂的寬場成像沒有提高，掃描過程又增加了系統的複雜度，不是自找麻煩嗎？StefanW.Hell的回答很簡單：只要設法縮小「管中窺豹」的「管」，就能提高系統的分辨能力，實現超分辨。

通常的熒光成像是這樣的：熒光分子在吸收了照明光（或者叫激發光）A之後，會在很短的時間持續發出熒光B。掃描成像系統的分辨能力取決於A在樣品處的聚焦光點大小。Hell找到了熒光的開關——第三種光C，在C的照射下，熒光分子即使吸收了激發光A，也沒法再發出熒光B。Hell讓開關C同樣打在樣品上，形成一個四周亮、中心暗的「麵包圈」，「麵包圈」中心的暗區域比艾里斑還要小；然後把麵包圈套在艾里斑上，就像在「管」的出口又加了一個小孔，使「管」的直徑大大減少，也就提高了整台顯微鏡的分辨能力。

圖6 「麵包圈」限制了激發光A的有效範圍

「我只看到星星」，「我看到了銀河」——光激活定位顯微

熒光分子是熒光樣品的最小發光單元，由於衍射極限的限制，在相鄰的兩個熒光分子同時點亮時，我們只能看到一個光斑，但如果每次只點亮一個分子，就可以通過光斑，計算得到熒光分子的準確位置。

EricBetzig和WilliamE.Moerner採用的就是這樣一種方法，如果說STED技術核心是「擦除」，那麼PALM技術的核心就是「定位」：Moerner發現存在光D可以「打開」熒光。通過控制D的照射劑量，保證每次只有少量熒光分子處在打開狀態；當熒光分子在開與關之間切換時，整幅圖像中的熒光信號就會像銀河中的星星一樣亮暗閃爍，只要進行足夠多次的開關和成像，就可以組合出整個樣品的圖像。

圖7 溶酶體膜在不同顯微鏡下的成像結果。（左）傳統光學顯微鏡成像；
（中）光激活定位顯微鏡成像；（右）放大的光激活定位顯微鏡成像。
圖片來源：果殼網

集百家之長，成一家之言——交叉學科的勝利？

作為光學發展史上的重大進步，衍射極限的突破顯然是一個物理學問題，三位科學家以化學方法為工具，突破衍射極限並摘走了2014年諾貝爾化學獎，由此受益最大的則是生物學。更有趣的是，三位諾貝爾獎得主都是物理學出身，因此超分辨顯微成像技術可以稱得上是交叉學科的重大勝利。

隨著超分辨技術的發展與成熟，國際上主流研究方向已經由系統本身轉嚮應用，幾大顯微公司也紛紛推出各自的商業化產品，但空間與時間、成本與性能的博弈還在持續，在可以預見的將來，超分辨顯微成像技術仍有進步的餘地。

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