一種酶可以在 37℃ 時活性最高，55℃ 時失活，這種酶可以參與聚合酶鏈式反應 (PCR) 嗎？
原題是：Can PCR be performed with an enzyme that is most active at 37 degree and is inactivated at 55 degree? If so, how?
老師出的一道奇怪的分子生物學的題目，我感覺是可以的，DNA高溫變性解鏈後，在低溫下會復性，如果所使用的酶在55℃下失活，但是未變性，則在溫度降低至37℃左右後可以恢復活性，促使DNA發生聚合，進行PCR反應。
大家怎麼看呢？
不是完全不可以，但很可能做不好。
有的知友認為題主所述的酶不能用來做PCR，因為變性時的95℃高溫會使酶失活。但真正的難點其實不在變性，而在退火。下面會講到，高溫對變性並不是必需的。但如果溫度過低，退火時特異性難以保證，引物容易結合到其他位點，導致擴增出雜序列。
高通量測序領域的龍頭老大illumina公司開發的橋式PCR技術（bridge PCR）就是恆溫的，而且的的確確是PCR技術，因為它保留了PCR的變性-退火-延伸三步反覆循環的特徵；而有的知友提到的HDA、RCA、LAMP、RPA等方法的變性、延伸等過程是同時發生的，只能算是和PCR並列的DNA擴增技術。
它是怎麼做到的呢？
它把兩種引物種在化學修飾後的固相表面上，每一輪延伸完了之後將反應液洗去，加入甲醯胺使DNA變性，再把甲醯胺洗去，進新的反應液延伸。模板被固定在固相表面上，不會被沖走。示意圖如下：[1]
發明橋式PCR的目的並不是單純為了擴增目的基因，而是為高通量測序作表面建庫。待測序的DNA樣品（已建庫）經過橋式PCR後，會在固相表面形成一個一個的DNA叢。這些DNA叢在測序反應中會發出熒光，依靠熒光的顏色可以判斷鹼基的類型。下圖是測序時拍攝的熒光照片的示意圖，每個亮點對應一個DNA叢，通過圖像處理識別出亮點，就可以讀出鹼基[1]。（這只是示意圖，真正的測序熒光照片跟飄雪花的舊式電視機似的，真不知道Illumina用了什麼樣逆天的圖像處理給識別出來的。）
為什麼要橋式PCR而不是直接把待測DNA種在表面上測？因為直接種，每個DNA分子只有一條，放出的熒光極其微弱，儀器很難檢測。橋式PCR起到了信號放大的作用。
橋式PCR為什麼要用甲醯胺變性，而且每一輪都換反應液，這不浪費嗎？因為高通量測序是非常精密的實驗，對晶元要求特別高，反覆熱循環會對晶元造成損傷，所以寧可燒錢，每一輪都換新的反應液。還有一個原因是原始的DNA模板只能在表面退火一次，否則多個不同序列的DNA很可能在表面長出相互重疊的叢，造成測序時信號混雜在一起，無法讀出鹼基。
一定要橋式PCR才能做高通量測序嗎？不一定。首先，把待測DNA擴增到表面有多種方法，PCR型的方法就還有454的BEAMing [2]，非PCR型的還有wild fire [3]等奇葩方法。其次，如果你信號檢測夠牛逼，單分子的信號也能檢測，那就是第三代測序。不過鑒於單分子信號太難檢測，三代測序現在還相當不靠譜。
除了高溫，讓DNA的雙鏈解開還有有很多方法，例如：- 用強親水的物質（甲醯胺、尿素等）去破壞鹼基間的氫鍵；（橋式PCR採用此方法）
- 一些酶，如解旋酶、RecA、具有鏈取代活性的聚合酶（Bst、phi29、DeepVent等）也可以解開雙鏈 [4]；（HDA、RPA、MDA採用此方法）
- 極低的鹽濃度本身就可以讓DNA解旋 [5]（鹽濃度每下降一個數量級，Tm值下降17℃，則20℃、1e-6 M濃度下，大部分DNA都會解旋）。
- DNA鏈末端本身會自發部分解旋，稱為「綻開」現象。Wildfire利用了這一原理 [3]。它在固相表面種上高密度的polyT，待擴增的DNA 3端有polyA可與之配對，然而polyA和polyT的配對是相當不穩定的，會自發解旋，處於不斷配對-解旋的動態平衡中。由於表面的polyT極密，解旋下來的模板很容易和相鄰的polyT配對，引發新一輪的延伸。如下圖：
所以，DNA變性根本不是個事。不讓用高溫，我有的是辦法。
但是，如果題主用這個55℃失活的酶在37℃做橋式PCR，我覺得雖然可能也會擴增出產物，但很可能包含很多雜序列。因為37℃下，引物和模板退火時結合的特異性太低，很可能結合到其他位點上，導致擴增異常。事實上，橋式PCR通常是在65℃進行的，剛好在引物Tm值附近。
以上。
參考文獻：- Metzker, Michael L. "Sequencing technologies—the next generation." Nature Reviews Genetics 11.1 (2010): 31-46.
- Diehl, Frank, et al. "BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions." Nature methods 3.7 (2006): 551-559.
- Ma, Zhaochun, et al. "Isothermal amplification method for next-generation sequencing." Proceedings of the National Academy of Sciences 110.35 (2013): 14320-14323.
- Dean, Frank B., et al. "Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification." Proceedings of the National Academy of Sciences 99.8 (2002): 5261-5266.
- Melting DNA
應@金晨羽要求，增加對LAMP的介紹。（請猛烈下拉至最後）
首先，知乎不建議任何考試題目的問答。（貌似好多人說過，不過不知道出處，我強烈贊同）
其次，知乎鼓勵思路的交流。（我腦補，你們隨意）
接下來，分享一下思路，兩種情況：
1.針對傳統的生物學方法：不能，原因建議你仔細了解下PCR的原理，看看原理圖就很清楚。
2.針對新型的生物學方法：可以，據我所知，已經有很多利用LAMP檢測病毒核酸的論文了，可以google了解下。
以上回答不糾結於PCR的目的，不糾結高保真與否，只是一個本科考試題目的思路而已。
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LAMP:Loop-mediated isothermal amplification（詳細定義請點擊鏈接）
變性那步不好做了，延伸也不好做了，即使辛苦點估計也難了。
哈哈哈，是可以的。
這只是一道題目。嗯。題主自己答的有點問題，蛋白的高溫失活是不可逆的。其實pcr就三個過程，變性，退火，延伸首先我們的模版很純，我們的pcr目的只是擴增這很純的模版，於是為了能用上這奇葩酶，我們得設計一個很短的primer，這樣的話完全可以因為其非常低的tm值而可以用很低的溫度退火，且假定這primer的鹼基序列正好特異性還不錯，tm值大約為30左右感覺差不多。其實難點是在變性上，正常的DNA變性都需要很高的溫度，我們在這裡引入一種DNA解旋酶，它能在在37度及以下的時候失活，在45度有很高的活性。這樣，45度DNA在解旋酶的作用下雙鏈打開，25度常溫退火primer結合到單鏈DNA上，37度這個奇葩酶正好可以延伸。於是就能做PCR了。嗯，這只是一道題目。話說那位講各種sequencing方法的很受益呀～謝邀
之前看錯題設了
你只考慮了蛋白什麼溫度失活什麼溫度復性
但你沒考慮DNA雙鏈必須在怎麼樣的溫度下才能完全打開在使DNA雙鏈完全打開的溫度下酶是否變性根據@蕭璘的建議 不詳細答了不可以啊…… PCR程序的高溫變性就94+攝氏度了……退火一般也55+攝氏度的說……PCR用的Taq酶或者Pfu酶 基本都是沸水中半衰期若干小時那種很牛的東西……
可以的，用PCR儀每次循環到延伸的環節溫度降到37度時，手動添加聚合酶，然後繼續。。。理論上也是在進行PCR反應啊。。。笨辦法！（我覺得在耐高溫的聚合酶被提取出來之前，人們就是採用這種方法進行PCR反應的，那時的PCR儀大概與現在的不同吧。。。。）
還有就是這兒 Protecting enzymes against heat inactivation by temperature-sensitive polymer in confined space
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Physical Chemistry Chemical Physics
(RSC Publishing) 有篇文章是用對溫度敏感的聚合物高溫時把酶包起來，低溫時把酶放出來，來保護酶免於失活的，也可以朝這個方向走走試試。
有意思啊，我很想問下，沒有發現高溫穩定的聚合酶時怎麼做的pcr ，看看歷史吧，最開始的時候，酶是每個循環添加的。
我告訴你吧：不可能。 簡單回答樓主一下：
根據PCR的流程來看：首先94度預變性——這一步酶失活，但這一步跟酶無關，pass然後進入循環，1.94度變性——失活但無關，pass2.退火（一般溫度50到65度左右居多）——極可能失活，但依然無關，pass3.72度延伸——酶失活，而且這一步正是酶發揮功能的時候，掛了。OKAY，後面72度總延伸就更不用說了，因為已經掛掉了最後樓主收穫的只會是一些亂七八糟的模板和單鏈，得不到任何PCR產物，over
事實上，只有nuts才會用工作溫度這麼低的聚合酶來做PCR，PCR用的酶都是往高耐受溫度了找現在美國軍隊使用一種常溫聚合酶，軍醫只需要把含有完整擴增體系的PCR管放在襯衣口袋裡就好，一個小時可以進行25輪擴增，可惜你買不著啊。所以對於你來說，不可行。
不可以，首先PCR (聚合酶鏈式反應）是體外擴增DNA片段的技術，變性的溫度為94℃，復性的溫度為55℃，而延伸的溫度為72℃，在延伸這一步會用到DNA聚合酶，故選用耐高溫的DNA聚合酶
行，但是不好用。樓上的那個橋式pcr是個神器。除此之外還有種聚合酶，能做strand displacement，我們用它和另外一種限制性內切酶（某nicking enzyme）一起用，做isothermal pcr，反應溫度剛好是55C。這個玩意對於template和primer的要求非常嚴格，要求一個template（ssDNA）上有兩個primer binding site並且這個ssDNA還不能打捲兒。這樣一個primer來了之後extend出了另一個primer，nicking過去把子鏈上切個口，於是從切點的地方繼續延伸，新合成的子鏈把原先斷了的子鏈頂下去，被頂下去的子鏈作為新的primer再去粘別的template。這種expar isothermal pcr被我們用來檢測miRNA let7-A。但是我跟你說，不好用。
另外作為一個TA，可以告訴你這道題屬於只要答案合理即可，萬萬別把樓上的橋式pcr原理原封不動的搬上去，這麼多字我們不會看的。答案請簡潔清晰明了，最好以步驟的形式分段書寫，並保持字跡可辨認。我批一道題一般只有5-10秒的時間（一百三十多份卷子，每份卷子十三道題每道2-4小問不等，三天完成）。如果對分數不滿意和TA好好解釋好好掰扯還有可能找回來幾分。如果你的TA是博士生千萬不要差評威脅不要哭天喊地，TA工作對於phd來說就是強制多餘添亂的工作，不做TA我們也有工資，而且還能多一點。phd一般很忙很累，哭天喊地只會讓人非常反感。可以，PCR技術剛開始是用的大腸桿菌的DNA聚合酶，就是每一輪反應都得重新加酶
當然不行了啊，你想想PCR的原理啊，延伸50-72℃，變性90℃，PCR第一步變性的時候酶就失活了，那接下來還怎麼知道擴增呢。不然為什麼人們還有尋找耐熱的酶呢，最初應用於PCR的酶是大腸桿菌Klnow片段，正是因為不耐熱所以科學家又從溫泉當中發現耐熱酶，現在的酶種類更多，我們一般都是用熱啟動酶，可以低溫下完全抑制非特異性產物，很大程度的提高擴增的特異性
....55℃酶就失活了，還怎麼擴增，這樣一般的擴增都不可以使用這款酶，當然了，除了你的退火溫度非常低，但是三四十度的退火溫度這種情況也很少見了，一般的擴增推薦使用熱啟動酶，擴增無非特異性條帶有保證
絕對不可能，DNA的解鏈溫度九十多度，一般的蛋白質全都滅活了，PCR用的酶都是在特殊細菌里發現的耐高溫蛋白
蛋白質？dna？這是什麼酶？
不可以，因為pcr的第一步就是要DNA雙鏈變性，DNA雙鏈非常穩定，要在95度左右才可以變性，即打開雙鏈，這樣才可以進行下面的退火、延伸步驟，而你的酶經過94-95度已經失活了，且高溫對酶的失活過程是不可逆的，所以進行不下去。
不可能。PCR那個高溫……人家用的酶是從溫泉微生物裡面提取出來的……
估計是不行的，pcr是需要很多circle的，到解鏈溫度就失活了
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