引物設計，so tricky

本文是《引物設計，so easy》的姊妹篇（傳送門 引物設計，so easy - 老司機的生物學課堂 - 知乎專欄），或者說是進階版，其中涉及的內容，沒有一定駕齡的司機是不知道的哦。

首先要借用Sketching Science的一幅漫畫來表達心情。儘管在上一篇中把PCR說得如此簡單，但實驗做多了，偶爾也會翻船。實時定量PCR實驗失敗了，引物設計往往要背一部分鍋。這篇文章就來探討一下，引物設計還需要注意哪些問題，以盡量提高實驗成功率。（註：依然僅關注qPCR定量mRNA的引物設計，不涉及其他應用。）

1. Location, location, location

假設Primer Blast返回了這樣的結果，在靠近mRNAn5』端有兩對引物，在3』端有三對引物，這時候我們應該選擇哪一邊呢？

答案是：最好選擇靠近3』端的那三對。

在理解這個答案之前，我們首先需要明白逆轉錄的原理。逆轉錄的過程，是逆轉錄酶通過結合RNA-DNA雜交鏈（即mRNA-逆轉錄引物），以dNTP為原料，沿著DNA的5』→3』端方向合成cDNA的過程。換言之，對於mRNA來說，逆轉錄酶是沿著它的3』端往5』端跑的。

逆轉錄反應，往往不能完美地獲得全長cDNA。如下圖所示，mRNA並不是一條直線、乖乖站好讓逆轉錄酶從後往前擼過去，而是具有相當複雜的二級結構甚至三級結構。

也就是說，逆轉錄酶要「翻山越嶺」，跨過重重障礙，才能從頭跑到尾。儘管某些逆轉錄酶可以在較高的溫度下進行反應（高溫有助打開二級結構），而且它本身也有解開二級結構的功能，但這些都是相對的。一旦在中間卡住，逆轉錄酶從雜交鏈上脫落，反應就中止了。因此，優勢cDNA產物往往會富集在靠近mRNA的3』端位置。

對於一些比較短的mRNA，選擇靠近哪一端的qPCR引物，其實並沒有什麼所謂，逆轉錄酶也不是那麼廢柴。然而有些基因的轉錄本超級長，比如出了名難克隆的人EP300基因的轉錄本有8761nnt，而最長的人類基因轉錄本TTN的transcript variant IC更是高達109,224 nt。這時候，我們還是不要為難逆轉錄酶了。

有些駕齡的司機都懂得，為了獲得全長cDNA，往往使用random hexamers（隨機六聚體）引物、甚至混入Oligo dT來進行逆轉錄。然而在qPCR定量基因表達水平的時候，本司機並不推薦使用random hexamers。儘管它可以最大程度提高獲得全長cDNA的概率，但是這時候所獲得的cDNA卻不能保證忠實地與mRNA的丰度成對應關係。因為在使用random hexamers獲得全長cDNA的同時，也會獲得大量truncated cDNA（截短體cDNA），因此這樣的cDNA混合物，就無法忠實反映原始的mRNA拷貝數。

在這裡，筆者順便推薦使用Anchored Oligo dT用於mRNA定量的逆轉錄，序列見下圖，相比Oligo dT多了兩個「錨定」鹼基。相關文獻PNAS. 2002 Apr 30; 99(9): 6152–6156.nAnchored Oligo dT能夠提高從mRNA的polynA尾巴開始逆轉錄的效率，降低由於轉錄本中央多聚腺苷酸序列的存在而導致產生大量truncated cDNA的幾率。

總而言之，盡量選擇靠近mRNAn3』端的引物就對了。

2. 依然是Location,nlocation, location的問題

qPCR是評估RNAi效率的快捷方法之一，尤其是當靶點找不到合適的抗體做westernnblot時，qPCR簡直又快又省事。然而有時候我們會發現，無論怎麼優化轉染條件，用qPCR一檢測，總是發現干擾不下去。每次遇到這種情況，通常只能鬱悶地換別的siRNA片段再做一次實驗。

設計RNAi的演算法，目前還不能給出近100%成功率的承諾，但qPCR得到干擾無效的結論，未必就完全是RNAi設計上的錯，還有可能是擴增引物設計的問題。

這裡列舉三篇文獻來解釋這個問題。這些作者都發現，qPCR擴增引物和siRNA的相對位置，是有可能影響最終的評價結果的。

BioTechniques Protocol Guide 2009 (p.47)

BMC Res Notes. 2010; 3: 53.

Biol Proced Online. 2011; 13: 1.

我們拿第二篇的數據來講解。

首先作者設計了2對針對人PRKCE（proteinnkinase C epsilon）基因的siRNA和5對用於擴增該基因的引物（set 1~5）。

隨後，用western blot證明了這兩對siRNA都是有效的。

同時，這5對擴增引物也是有效且特異地擴增出了單一條帶。

然而通過qPCR實驗卻發現，不同引物得到的「干擾效率」卻是不一樣的。

綜合三篇文獻的研究數據可以得出一個共同結論，針對於文中所研究的基因，引物設計在siRNA切割位點附近才能得到陽性結果。（注意是綜合起來的共同結論，不要跟我拽上面這篇文章得不到這個結論 [再見]）

理論上，RNAi介導mRNA切割後，mRNA降解往兩個方向進行（如下圖的C所示）：5』端碎片沒有poly A的保護，降解從3』→5』進行；3』端碎片沒有m7G cap的保護，降解從5』→3』進行。因此，如果mRNA降解不完全，殘留的「屍體」就會被random hexamers引物給逆轉錄出來。而傳統的OligondT（沒有錨定鹼基）逆轉錄引物，似乎對mRNA中間的多聚腺苷酸序列（也就是中央的AAAA……多聚A序列，而非尾部的poly A尾巴）有偏好性（根據文獻計算的優勢比，中央多聚A：尾部多聚A ≈3：1），因此如果屍體存在多聚A序列，也容易被Oligo dT傾向性地逆轉錄出來。而此時，如果擴增引物設計的位置遠離切割位點的話，就會出現擴增信號，導致誤判。

這裡也再次凸顯出Anchored oligo dT用於逆轉錄的好處。首先它不會逆轉錄缺乏多聚A序列的mRNA屍體。就算屍體存在多聚A序列，錨定鹼基能夠保證中央：尾部n≈ 1：1地獲得cDNA，也能盡量降低誤判的程度。

然而，並非所有基因都有類似的情況，具體的機制不明。在這裡只能說，在設計用於檢測RNAi效率的qPCR引物時，要多長一個心眼了。有時候，得不到陽性結果這個鍋，並非總要由siRNA片段來背，而有可能是引物設計的問題。

最後祝各位PCR愉快！

（沒想到這個周末居然一口氣擼了兩篇文。下周停更好了……）