韓春雨：「一鳴驚人」的中國科學家發明世界一流新技術 | 特稿

題圖：韓春雨。本文照片均由韓春雨提供

編者按：

「河北科技大學在哪裡？」「韓春雨是何方神聖？」

最近幾天，中國生物學界沸騰了。其中有世界著名的生物學家、也有年輕研究員、活躍的研究生，大家議論紛紛。近年國際上因為基因修飾技術而激烈爭議誰應該得諾獎，而來自河北科技大學、名不見經傳的副教授韓春雨的工作打開了新局面——不是說他會得諾獎，而是有可能他發明的基因修飾新技術會替代現有技術而成為最實用的，更為重要的是：這一發現具有帶來技術和產業變化的潛能。

令國人激動的是，韓春雨在河北科技大學條件不好、經費缺乏、人員很少的情況下做出的研究優於世界一流的麻省理工、哈佛、斯坦福。《知識分子》主編、北京大學教授饒毅將韓春雨推介給編輯部，在此我們特別刊出專訪，以饗讀者。

撰文 | 陳曉雪、王承志、程莉

責編 | 李曉明

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今年5月2日，韓春雨與合作者的文章終於發表了——先被《科學》（Science）審稿小半年後拒稿，後歷時9個月終被《自然生物技術》（Nature Biotechnology）接收。

接下來的幾天里，他每天都要收到幾十封、甚至上百封來自同行的郵件，但並不是每封都能及時回復。

「因為實驗室人手有限，處理不過來那麼多郵件，還望同行海涵。」《知識分子》第一時間聯繫上了韓春雨，電話那端的他滿是歉意。

而此刻，新的基因編輯技術引起國內同行的熱切關注，人們紛紛追問：「誰是韓春雨？」

01

更精確，效率更高

今年42歲的韓春雨是河北科技大學的一名副教授，因為這篇新發表的工作「一鳴驚人」。

簡單地說，韓春雨團隊發明了一種新的基因編輯技術（NgAgo-gDNA），適合在人類細胞中基因組編輯，不同於已有最時興的技術（CRISPR-Cas9）。後者通過RNA尋找替換序列，而新技術通過DNA作為介導尋找替換目標。

NgAgo是Natronobacterium gregoryi Argonaute這一短語的簡稱。韓春雨團隊就是利用格氏嗜鹽鹼桿菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute實現了DNA引導的基因組編輯，並發現NgAgo作為一種DNA介導的核酸內切酶，適合在人體細胞中進行基因組編輯。

Argonaute作為一個核酸內切酶家族，最早由荷蘭瓦赫寧恩大學(Wageningen University) 的約翰-范德歐斯特（John van der Oost）研究組證明這一家族的同源蛋白酶活,可以有效地利用單鏈脫氧核糖核酸作為短介質，去相對精準地切割基因組靶點。

范德歐斯特的這一發現開啟了基因組工程的一個新篇章，因為之前的大多數基因組工程研究是基於RNA的（CRISPR-Cas9、TALEN等，鋅指蛋白是基於DNA的但是沒有實現可編碼的優勢），哈佛大學分子與細胞生物系副研究員段昕認為，「這一進展給大家引入了一個新的思路去進一步改造」。

目前世界各個實驗室最為流行的基因編輯工具是CRISPR-Cas9。從原理上來說，早期的DNA編輯技術是通過蛋白（如鋅指蛋白）來尋找需要替換的序列，而Cas9則是通過RNA（引導RNA，即gRNA）來尋找替換的序列，由於比操作蛋白質簡單得多，Cas9技術得以迅速被廣泛使用。

但是，Cas9需要19個配對的鹼基，並且要求在需要編輯的基因組上這19個鹼基後面必須緊鄰一個符合一定特徵的三鹼基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設計，而NgAgo–gDNA系統不需要PAM序列，拓寬了其設計範圍。

NgAgo結合24個鹼基的gDNA，這比Cas9的gRNA（19個鹼基）要長5個鹼基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當於在一本書中的某個位置找到一個單詞將它替換成另一個單詞，並且要保證書中其它地方的單詞不被替換。顯而易見，如果替換的是the這樣的簡單單詞，那麼可能從書中找到多個地方，而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi這樣的單詞則不太可能找錯。

韓春雨團隊的研究還發現，NgAgo–gDNA系統對嚮導序列-靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個鹼基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統比Cas9系統效率更高。

NgAgo的gDNA需要5』端磷酸化的單鏈DNA （5p-ssDNA），這種形式的DNA在哺乳動物細胞中幾乎不存在，這保證了NgAgo不會被內源的DNA序列錯誤帶到不該去的地方。該系統的另外一個優點是5p-ssDNA是外源轉化進細胞的，其時間和濃度可以非常精確地控制。而Cas9系統的gRNA是內源表達的質粒,難以精確地控制。

韓春雨團隊在論文中還介紹，與Cas9相似，Argonautes在基因表達抑制及抵禦外源核酸中起關鍵作用。但是，Argonautes在許多方面不同於Cas9。比如，Cas9隻存在於原核生物中，而Argonautes在進化過程中保守，存在於幾乎所有生物體中；儘管大多數的Argonautes結合單鏈(ss)RNAs，在RNA沉默中起重要作用，一些Argonautes卻可以結合ssDNAs並切割靶DNA；正確的Cas9結合要求嚮導RNA必須有一個3′RNA-RNA雜化結構，而Argonaute結合則不要求特異的一致的嚮導RNA二級結構；Cas9隻可以切割PAM上游的靶序列，而Argonaute不要求靶序列上存在特異的序列。當Argonaute與嚮導序列結合時，它們可以影響彼此的生物化學特性，並作為一個整體起作用。

「因此，從理論上說，NgAgo的脫靶率更低」，韓春雨告訴《知識分子》。

02

「幸好NgAgo足夠給力」

1974年出生的韓春雨是石家莊人，他本科畢業於河北師範大學，這是一所位於石家莊的高校，也是他父母任教的地方。

1995年，韓春雨來到北京，先是在中國農業科學院攻讀碩士學位，後在中國協和醫科大學（中國醫學科學院）接受博士研究生訓練，2003年獲得博士學位。此後的他，並沒有尋找教職，而是在協和的實驗室繼續一項關於「人類Bex2與LMO2相互作用、調節新型DNA結合複合物的轉錄活性」的研究，2005年該結果發表在《核酸研究》（Nucleic Acids Research），韓春雨為第一作者，這篇文章也成為他科研生涯中具有標誌性的成果。

2006年，32歲的韓春雨離開北京，回到了石家莊，在河北科技大學擔任教職。十年後，韓春雨發表了他獨立研究生涯以來最為重要的工作。

韓春雨的研究方向是真核基因表達調控，特別是和腫瘤相關的基因，以及表觀遺傳相關蛋白，RNA的功能研究，例如，長非編碼RNA的功能及其他。近些年基因編輯技術，尤其是CRISPR-Cas9的不斷完善，深刻地影響到整個生命科學領域，韓春雨的實驗室也用上了CRISPR-Cas9這一工具，他本人也一直在關注基因編輯領域的進展，有過一些想法，但並沒有下決心動手。

促使韓春雨真正動手的是2014年年初的兩篇文獻，其中一篇是范德歐斯特研究組發表在《自然》（Nature）雜誌的關於「DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute」。這篇研究顯示，TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)能以DNA為模板切DNA。段昕介紹，范德歐斯特工作的局限性在於他們實驗所需要的溫度在65-75攝氏度，這使得很多實驗不能在生理條件（哺乳動物在37攝氏度左右）下完成。

當時,北京大學的一位研究員得知范德歐斯特的研究後非常興奮。他判斷，TtAgo可以發展為一個更簡單的基因編輯工具，併產生了一個想法：哺乳動物中是否在特定時期或特定細胞中存在類似現象，比如決定細胞分化或抗體形成的過程。不過，他的實驗室在合成了人源密碼子優化的TtAGO 後，嘗試了幾次切GFP序列，卻以失敗告終。

幾乎在同一時間，韓春雨的實驗室進展則十分順利，「大概是兩個月就有結果出來了」。

段昕介紹說，韓春雨團隊做的，就是進一步搜尋Argonaute的同源蛋白。幸運的是，大量的已知大型測序數據給了他們很多有效的幫助，找到並進一步證明了來自不同菌株格氏嗜鹽鹼桿菌的Argonaute同源蛋白可以在生理條件下實現類似的功能。「韓的工作把系統進一步優化，而且使得短介導DNA的準確性和識別長度有了重大突破。」段昕說。

北京大學生命科學學院研究員魏文勝課題組也想嘗試DNA介導的Argonaute，但TtAGO的特點是工作溫度比較高。「這篇文章比較聰明，還是走對了路，沒有研究如何使高溫才能工作的酶通過構象改變達到降溫，而是找到這樣一株可以在37度工作的Argonaute。」 魏文勝告訴《知識分子》。

之後，韓春雨一邊向《科學》雜誌投稿，一邊和實驗室的幾個學生一起完善結果。他說，當時文章最主要的結果是NgAgo確實可以做基因編輯工具，但「審稿人要求的比較完美」，來回審了小半年之後，「最後被拒了」。

2014年秋天，韓春雨跟沈嘯提起自己正在做的NgAgo的工作，提出了幾個候選的工具。「這麼好的課題和想法，我當然全力支持並加入了」，沈嘯向《知識分子》回憶道。

沈嘯是浙江大學醫學院基礎醫學系研究員，此前他在中國協和醫科大學博士畢業前一年，與韓春雨合作了發表在《核酸研究》的論文。2003年博士畢業以後，沈嘯在美國Emory大學從事博士後研究，2008年開始擔任美國Cedars-Sinai Medical Center的研究員科學家，2013年被聘為助理教授，2015年入選浙江大學「百人計劃」。

在被《科學》拒稿後，韓春雨和實驗室的學生繼續補充實驗，而沈嘯在項目和實驗設計上提供建議，他們發現了更多關於NgAgo的特性。

「幸好NgAgo也比較給力，發現它是one-guide faithful的。」韓春雨笑著說。

2015年6月3日，這篇僅有五人署名的文章的被投往《自然生物技術》，9個月之後，文章被接收，今年5月2日在線發表。

03

「文章發出來是好事，也是壞事」

在整個生物界唯強大的CRISPR-Cas9馬首是瞻的時代，韓春雨的這一發現引發了諸多媒體和同行的熱情關注。

有評論認為，「（如果）未來中國任何一所普通的科研院校都能出現這種激動人心的科研成果，那麼中國的科研實力才是真正的達到世界領先水平」。

國內關注生物行業的媒體評價說，「該成果核心為一項替代目前通用的Cas9的基因組編輯新技術，這一成果打破了國際基因編輯技術的壟斷」。

韓春雨表示對此評價不敢苟同，他認為，NgAgo–gDNA系統和Cas9都為基因編輯應用提供了更好的工具和多樣化的選擇，各有各的用處。

沈嘯向《知識分子》表示，他對NgAgo可以取代Cas9 的評價持謹慎態度，「最客觀的說法是找到了新的基因編輯工具」。

沈嘯說，Cas9基因編輯系統有點複雜，每當把它某一個劣勢用某種技巧修正後，使之特性更高、更有效，就會是一篇很好的論文，每進行一個改良，就是一篇CNS的論文。「大部分人包括一些科學家可能自然而然受一種權威的影響，Cas9太強大了，大家都把目光集中在Cas9上，想怎麼磨這把刀，把它做得更好更漂亮。」

正是因為Cas9太熱，很多人就忽視了去尋找更好的甚至先天就可以規避這些問題的工具。前述北京大學的研究員告訴《知識分子》，2014年的時候，他們也在做TtAGO的實驗，但部分因為依賴Cas9而放棄繼續研究Argonaute 。「學生覺得不太靠譜，而實驗室里其他人Cas9 用得十分熟練，都覺得沒有必要再換了，我也沒有堅持,」他不無遺憾地說。

韓春雨團隊的工作已經證實了一個新的、有自己特點和優勢的基因編輯工具，但是如何利用它，找到它更多的特性，還有很多工作要做。

「我和韓春雨現在是非常非常急迫的心理，文章發出來是好事也是壞事，好事是這項工作讓大家知道了，壞事是大範圍的競爭，我們的工作是不是能趕上趟，繼續做下去，是不是我們中國的科學家還能繼續報道它,」沈嘯說，國外的很多實驗室設備條件非常強，「我們沒法比，他們一上來做的話，很多東西會很快出結果。」

04

石家莊的四人實驗室

無論是在微信圈還是海外華人的論壇，人們不約而同地將韓春雨和麻省理工學院博德研究所的核心研究員張鋒聯繫起來。1981年出生的張鋒同樣來自石家莊，他以在基因編輯領域的諸多貢獻而被人們所熟知，包括首次報告了CRISPR-Cas9在哺乳動物體基因組編輯中的應用，找到更小的Cpf1蛋白來替代Cas9酶。

與韓春雨一直在國內接受科學訓練、從事研究不同，張鋒有海外學習的背景，更有在知名實驗室研究的經歷。11歲那年，張鋒隨母親到美國愛荷華州的得梅因定居，高中時就在一個基因治療實驗室實習，全獎進入哈佛大學學習化學和物理學，期間跟隨知名華人科學家莊小威做過研究，後來到光遺傳學主要發明人之一卡爾·戴瑟羅特（Karl Deisseroth）在斯坦福大學的實驗室，參與到光遺傳學發明的部分工作。在哈佛大學短暫地停留之後，張鋒受聘於博德研究所，一個科研經費和研究人員都可以在美國排到前列的研究機構。

而在河北科技大學生物科學與工程學院的實驗室，「離心機是『飛鴿』牌，與國內自行車品牌相同，從0加速到12000轉大概需要1分鐘的時間，」韓春雨不無幽默地說。

直到今天，韓春雨所在的的生物科學與工程學院還沒有博士點，韓春雨實驗室的學生都是碩士研究生。理論上，韓春雨每年可以招五六個碩士研究生，但是真正能夠跟他一起專註科研的，也只有一兩個人。

包括《自然生物技術》的這篇論文，跟韓春雨一起做實驗的一共三個人，其中第一作者高峰兩年前就從河北科技大學碩士畢業，那時NgAgo的主要結果剛剛做出來，高峰沒去找工作，也沒有申請博士，而是留在導師韓春雨的實驗室繼續工作，為了省錢，甚至睡覺都在實驗室。這一情景與韓春雨當年博士畢業後留在協和繼續未完成的科研工作有著驚人的相似。

「韓實驗室的工作是很了不起的，」北京大學生命科學學院饒毅實驗室研究生張翼評論說，「他們唯一的生物信息學工具可能是NCBI-psiBLAST，他們的Argonaute都是從菌種庫買來的菌裡面克隆出來，根本沒有花錢合成基因。」

很多人對韓春雨能夠在如此簡陋的環境下取得開創性的工作感到驚訝，但是他的大學同學、河北師範大學特聘教授徐小冬告訴《知識分子》，她對韓春雨能夠做出現在的工作一點也不感到奇怪，雖然韓春雨沒有海外留學經歷，但是也受到了很好的專業科學訓練，她認為，對一個受過專業科學訓練的科研工作者來說，佔用資源的多少並不會決定他是否能夠做出很好的工作。

「他這個人蠻有個性，從來不是那種循規蹈矩的人，他能夠堅持一些東西，守著自己的一畝三分地，也敢於表達自己，挑戰威權……投稿能夠較這麼長時間的勁，說明對自己的工作很有自信。」徐小冬說。

如今，面臨四面八方湧來的合作邀請，韓春雨統統交給沈嘯來處理。「他見識廣，也是一個好的合作者……我主要在實驗室幹活，而且我也喜歡這樣的生活。」韓春雨說。

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北京大學生命科學學院張翼：

「還有多少有潛力的中國科研工作者沒有被支持？」

近年來，Type II CRISPR系統（以SpCas9為代表）的應用在分子生物學和生物工程中產生了巨大影響。科學界仍然在尋找和發展更靈活可用的CRISPR衍生系統，例如能造成更複雜的核酸替換(dCas9-AID)，核酸單鏈剪切(dCas9 nickase)和粘性末端剪切(Type V CRISPR, CpfI)的CRISPR衍生工具。同時由於CRISPR系統的種種技術和商業上的局限性，科學界也在尋找其它可用的類似核酸酶系統。

韓春雨等的工作，是在2014年和2015年John van der Oost組的研究基礎上更進了一步。van der Oost是一位微生物專家，他參與了CRISPR系統機理的最早研究，也參與了Type V CRISPR系統的發現。2014年，van der Oost組首先報道嗜熱細菌T.thermophilus的Ago（TtAgo）具有在5』磷酸化小DNA片段（guide ssDNA）引導下切割靶DNA的能力。2015年，他的實驗室又報道嗜熱古菌P.furiosus的Ago（ PfAgo）也具有類似能力。Argonaute蛋白家族在高等生物RNAi過程和表觀遺傳學過程中發揮重要作用，一直很熱門，也正因此很早之前就有許多結構生物學家撲上去做結構。由於高等哺乳動物的Ago結構一時半會很難做完，就先搞出來了一堆低等生物的Ago結構，其中就有前面說過的TtAgo和PfAgo，早就知道它們能結合guide ssDNA，結構也很早就做清楚了，只是不知道後面居然還能有這種用處。以前RNAi熱門，大家都去做切RNA的實驗，現在CRISPR熱門，大家都去做切DNA的實驗。與這個邏輯類似的，2016年四月Doudna組報道在某些CRISPR操縱子，比如細菌M.piezophilla的CRISPR operon里，並沒有Cas核酸酶，但存在Argonaute編碼序列。由於Argonaute是已知的攜帶RNAseH結構域，具有核酸酶活性的蛋白，他們猜想這個Ago可能跟本來應該在那的Cas9起的作用差不多。後來他們發現這個MpAgo是個使用5』羥基化小DNA片段，對單鏈靶核酸（DNA/RNA）進行切割的奇怪的酶。所以結合5』p DNA的Ago並不是一個全新的東西（十年前就知道），靶向DNA的Ago本身也不是一個全新的東西（兩年前就知道）。

其實之前這些工作，在科學角度上來說都跟韓春雨等的工作意思比較接近了，但是問題是之前找到的TtAgo, PfAgo，包括Doudna組報道的MpAgo，來源都是嗜熱菌，生境決定了它們只能在65攝氏度以上進行反應，無法應用到哺乳動物細胞系統。所以從工程上來說這些都是沒有用的，需要應用的話一定要用工程手段。韓實驗室的工作是很了不起的。他們很缺經費，這個看得出來。他們唯一的生物信息學工具可能是NCBI-psiBLAST（只需要複製黏貼就能進行），他們的Ago都是從菌種庫買來的菌裡面克隆出來，根本沒有花錢合成基因。就在這麼艱難的工作環境下，他們用勇氣和堅持，作出了令人欽佩的工作，不僅找到了NBT文章中報道的NgAgo，還找到了一大堆別的Ago，都具有在低溫（10-50攝氏度）下結合5p-ssDNA，造成靶DNA雙鏈斷裂（DSB）的能力。NgAgo切割靶DNA的效率，比SpCas9切割效率要高；NgAgo脫靶的概率，比SpCas9低；而且NgAgo不需要PAM motif作為前置，這樣設計切割位點的時候可以隨便設計；NgAgo的尺寸也不大，只有2k多一點，比SpCas9小。更重要的是，DNA-DNA duplex的特異性遠比RNA-DNA duplex高。他們工作本身是很紮實，結果也做得很漂亮。這個工作不但拓展了Ago的生物化學（之前沒有過這樣的用一條guide ssDNA就可以造成DSB的酶，而且NgAgo會隨機的在切開以後去掉1-20個鹼基），也拓展了Ago的生物學。比如藻類的Ago也有這樣的能力，這是以前可能想不到的。

跟CRISPR系統類似，Ago蛋白家族的進化也很複雜，不僅在真核有，在藻類，古菌和細菌里都有。真核的Ago來源是古菌，但是在更底層的物種裡面，Ago在各物種中跳來跳去，有很多橫向轉移。實際上，在這些宿主物種里，經常有DNA的橫向轉移。分子生物童工們都很熟悉的感受態，對於很多菌來說可能就是個常態。在這種生態環境下，寄生性的DNA，比如轉座子和病毒，對宿主製造的壓力是很大的。具有橫向轉移能力的菌，也很容易通過橫向轉移來接收Ago operons。這種情況下很容易進化出使用5』p ssDNA guide的site-directed nuclease，作為宿主天然免疫系統的一部分。事實上，TtAgo最早發現的生物學意義就是使宿主能區分正常種內交配傳來的DNA和未知來源的外源DNA（2014年Swarts等，Nature；2015年Blesa等，J.Bacteriology）。所以我們可以期待很快發現更多具有類似能力或者更奇特能力的Ago蛋白，比如使用特殊的金屬離子，使用特殊的5』修飾結構，等等。甚至類似Cas9，使用RNA guide來切DNA，這些都是有可能的。有時候可能通過猜也能猜出點東西，比如看Ago結合核酸區域的電性，或者就直接看這個宿主菌的生境裡面都有什麼病原體，說不定都能有有趣的發現。

說實話這類工作的進步，首先有賴於基礎微生物學和生態學的研究，其次依賴於小科學風格的經費支持。對於韓組來說最困難的時刻肯定是過去了，問題是還有多少有潛力的組沒有被支持。至於說NgAgo能不能應用到轉化領域，這幾乎是一定的，因為基因編輯的市場太大。一定會有無窮多的人撲上來打結構，發文章，申請經費。現在即使不好用，修一下就會好的。何況既然細菌能進化出使用5』p ssDNA guide的酶，就一定有一個生產5』p ssDNA的辦法，研究清楚就好說。 比如說吧，存在類似piRNA biogenesis里的Ping-pong reaction那樣的nickase-dependent DNA amplification機制，是非常有可能的。

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