腫瘤的異質性與進化耐葯

腫瘤異質性是指同一種惡性腫瘤在不同患者個體間或者同一患者體內不同部位腫瘤細胞間，從基因型到表型上存在的差異，這種差異發生在不同個體中可表現出不同的遺傳背景，比如染色體量與質的差異，不同細胞病例類型、不同臨床階段不同分化程度細胞演進的多樣性；發生在同一腫瘤患者體內可表現出不同部位或同一部位腫瘤細胞間的突變基因譜和生物學特性等方面的不一致，體現了惡性腫瘤在演進過程中的高度複雜性和多樣性。

腫瘤異質性分為空間異質性、時間異質性、解剖異質性、結構異質性、基因異質性和功能異質性等。

2012年科學家對兩個腎癌患者的原發灶、轉移灶樣本進行基因測序，發現即便是同一個患者的兩個樣本，其基因突變也是不同的。每一個患者身上的不同樣本能發現100個突變。

圖1 原發灶、轉移灶、同一病灶不同位置基因突變存在很大差異

2015年，日本學者Akito Hata等對145名NSCLC患者在第1、2代EGFR TKI耐葯後進行了再次活檢，其中30位患者進行了多個部位的再次活檢，另外24位患者進行了同一病變部位的再次活檢。

30位患者中，有22位患者的再次活檢部位分別來自腦轉移病灶（20位來自腦脊液，2位來自腦組織）和胸部病灶（7位來自肺部，14位來自胸腔積液，1位來自淋巴結）。其中，有12位患者胸部T790M突變陽性。而在這12位患者中，有10位患者腦轉移病灶的T790M突變為陰性；另外有3位患者胸部再次活檢T790M為一種空間異質性突變狀態。

24位同一病變部位再次活檢的患者中，有5位患者在TKI暫停後T790M突變從陽性變成陰性。其中3位患者在進一步使用TKI後T790M陰性又變成了陽性。一位患者在大劑量的厄洛替尼的治療後其腦轉移病灶再次活檢結果從T790M陰性變成陽性。

在2017年18屆世界肺癌大會（IASLC WCLC 2017）上，美國麻省總院（MGH）的Piotrowska報道了系列活檢標本與TKI靶向治療耐葯的時間和空間異質性的分析。回顧性分析了221例EGFR突變的患者在靶向治療耐葯後的355個組織標本，耐葯後的第一次活檢標本發現有61%的T790M突變，5%的MET擴增，3%的SCLC轉化，2%的PIK3CA突變及1%的BRAF突變。

重要的是：83例患者有兩次以上的耐葯活檢標本，其中52%（43/83）患者的兩次標本中突變具有異質性，20%的患者T790M在第二次耐葯標本中丟失了，而有11%患者的第二次耐葯標本則獲得了T790M。17例T790M丟失的患者中，3例出現了MET擴增或BRA F V600E突變。

部分患者同時性的多個活檢標本中則發現了空間分子分布的異質性，如T790M/C797S、MET擴增等變異在同一患者的不同病灶中分布是不同的，即一個病灶存在，而另一個病灶不存在這些突變。該研究強調了動態檢測的重要性，耐葯機制的多樣性、時空異質性和單個活檢材料的局限性使得對於耐葯機制的判斷可能會帶來偏差。

美國科羅拉多大學和日本大阪Kindai大學的聯合研究報道，未經治療的患者中的肺癌遺傳進化與空間異質性的關係。通過收集未經治療的4例NSCLC、1例SCLC患者屍檢的腫瘤標本和非癌組織，採用RNA測序方法分析突變的進化和空間分布，每個患者具有5-9個原發或轉移的病灶。

結果發現癌病灶與非癌組織、原發灶與轉移灶均能被聚類分析明確區分於不同的集合中，信號通路分析還發現了細胞周期、DNA複製、DNA聚合酶、免疫相關信號通路與轉移灶相關。

這個研究提示在未經治療的患者中，轉移灶與原發灶存在分子突變和信號通路方面即存在相似性，又存在異質性，為突變分子的空間異質性的形成提供了初步資料。

上述兩個研究為肺癌在自然進展或治療條件下進展過程中的分子異質性規律提供了初步數據。特別是在EGFR突變的患者中，耐葯病灶中存在耐葯機制的複雜多樣性，同時會發生時間軸上動態變化，如重要耐葯機制T790M，C797S，MET擴增等在不同時間點的活檢標本既可能消失，又可能再次出現，為臨床克服耐葯精準方案的選擇提出了更大挑戰。

很顯然，臨床需要以時間上動態、空間上多點的眼光看待腫瘤的耐葯與進化，結合基因檢測技術的應用，才能準確把握克服耐葯的決策。

應用實例

一位55歲高加索男性患者於2011年10月被確診為IV期肺腺癌，通過Sanger測序法檢測出EGFR L858R突變。在接受了包括厄洛替尼、順鉑/培美曲塞，阿法替尼/西妥昔單抗的多線治療後，患者在2013年7月出現疾病進展。

對患者左肺上葉原發灶重複活檢進行二代測序的基因分析發現L858R突變和2個不同的TP53突變，但未發現EGFR-TKI耐葯突變，換用多西他賽/吉西他濱的治療方案後，在2013年9月發現病情大規模進展（肺、肝、心肌以及左臂軟組織）。

在左臂的轉移灶中重複活檢發現L858R突變，C277突變及高表達的MET擴增，但未發現T790M突變。改用厄洛替尼聯用克唑替尼方案治療一周後，患者左臂、肝、心肌出現明顯的反應療效，隨之伴隨患者的PS評分提高。然而，在患者原發灶並沒有體現藥物療效。

在2013年12月，患者表現出越來越多的呼吸困難。儘管在肝部和軟組織轉移灶中腫瘤得到控制，但在心肌轉移灶發生了疾病進展，聯合治療仍在持續。

2014年1月，患者產生呼吸困難以及左胸腔積液，取胸水進行分子檢測發現L858R突變、R110C突變，低水平MET擴增及T790M突變，在外周血標本中也檢測到相似結果。之後克唑替尼被停用，患者在2014年2月開始入組奧希替尼臨床試驗。

2周後評估顯示，患者原發灶腫瘤得到控制，但肝部和心肌腫瘤進展明顯。由於入組實驗不允許聯用其他抗腫瘤葯，患者退出入組並重啟克唑替尼治療方案。

三周之後，觀察到和之前幾乎一樣的轉移灶代謝反應，推測轉移灶由高表達得MET擴增基因驅動。然而，由於遭受多次複發的胸腔積液，患者狀態惡化，於2014年4月去世。

表1 患者前後6次基因檢測結果

該例子展示了一個患者在不同腫瘤部位存在2個不同的EGFR-TKI獲得性耐葯機制（T790M和MET擴增）的情況，儘管重複活檢指導可以暫時控制腫瘤，但由於腫瘤的克隆異質性導致腫瘤不能被持續控制，最終導致疾病嚴重進展。

這些臨床觀察不僅僅提供了一個早期聯合治療獲得性耐葯的理論依據，也指出我們當下對於檢測到驅動突變指導治療方案的認知局限性，並強調目前的分析證明了肺癌患者基因的變化性。

肺癌是分子異質性高度複雜的疾病。對肺癌的分子時空異質性分布的分析越精細，對於肺癌精準方案的應用就會更精準，對於療效的判斷也會提供更多分子機制的解釋，對於耐葯策略的制定提供更好的科學依據。

用進化的思維去應對腫瘤的耐葯，利用這個思想巧妙地與腫瘤進行周旋，結合基因檢測技術的應用，達到長期獲益，是目前應對腫瘤異質性及進化耐葯的一個重要思路。

參考文獻

1.Willyard C，Nature. 2016 Apr 14;532(7598):166-8.

2.M Scheffler, S Merkelbach-Bruse, M Bos, et al. J Thorac Oncol. 2015, 10(6): 40-3.

3.Akito Hata ,Nobuyuki Katakami, Hiroshige Oncology 2015.