化學專業保研手冊-第十二章：化學前沿（熒光探針概論）

熒光（fluorescence）是一種光致發光的冷發光現象。當某些物質受到光、電、磁、化學等能量激發後，電子吸收能量從基態躍遷到激發態，而處於激發態的電子不穩定，會通過輻射躍遷和非輻射躍遷兩種衰變方式返回到基態。輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發射，即產生了熒光和磷光；非輻射躍遷包括振動弛豫（vibrational relaxation）、內轉化（internal conversion）和系間竄越（intersystem crossing），由於非輻射躍遷會造成能量損失，因此發射光子的能量一般小於吸收光子的能量，故而熒光物質的發射光譜波長通常要大於吸收光譜波長。電子由第一激發單重態（又稱單重激發態、S1單線態）的最低振動能級回到基態時，會以發光的形式釋放出能量，所發出的光為熒光；電子由第一激發三重態（又稱三重激發態、T1三線態）的最低振動能級回到基態時所發出的光稱為磷光。

一、熒光探針需滿足的條件

1. 易於合成純化，產率高，安全無毒；

2. 較好的穩定性和溶解性，尤其是透膜的脂溶性；

3. 能與被標記物通過物理或化學作用特異性結合，標記條件溫和，殘餘物及副產物易於除去；

4. 較高的熒光量子產率，摩爾消光係數大，有較強的抗漂白能力，熒光與背景對比明顯，激發、發射波長能有效避免細胞自發熒光的背景干擾。

二、近紅外（NIR）熒光探針的優勢

1. 近紅外光檢測樣品穿透性強、成像解析度高、檢測靈敏度高、信噪比高

2. 在可見光區，生物組織的某些成分會自激發產生自發熒光，同時樣本的散射光強度較大，嚴重干擾熒光檢測及成像示蹤。近紅外熒光自發熒光背景低。

三、細胞內活性小分子（RSM）的NIR檢測方法

細胞內RSMs往往壽命短、反應活性大、濃度極低（多為納摩爾及以下）、對環境敏感、自身無熒光。因此必須藉助熒光探針的特異性捕獲標記，使之具有近紅外熒光性質。

四、熒光探針廣泛應用於生物大分子研究的原因

分子熒光探針被廣泛地應用在研究蛋白質等生物大分子接觸面發生的表面誘導的構象變化。在直接分析法中，熒光分析法應用廣泛且優於間接分析法，因它沒有破壞結合的平衡，最接近反應的真實存在。

五、熒光探針作光敏劑藥物能量給體的優缺點

熒光納米探針不僅可以作為藥物載體與光敏劑藥物分子結合以形成多功能納米材料，還可以作為光敏劑藥物分子的能量給體以提高其單線態氧產生效率。光敏劑與熒光染料的吸收和熒光發射光譜較少重疊，從而有效避免了分子間因能量轉移導致的熒光猝滅、單線態氧產生效率降低、熒光成像同時因光敏劑被迫激發而導致的組織損傷等後果。但在熒光成像的同時，光敏劑因被迫激發而產生的單線態氧也可能會與激發態的熒光探針發生光化學反應並導致熒光猝滅，且成像時可能暴露量子點潛在的毒副作用。因此，設計合適的納米載體構型，將光敏劑藥物分子與熒光探針物理隔離，是避免發生此類光化學反應的有效途徑。

六、熒光分子探針的組成及功能

1. 識別結合基團（Receptor）：選擇性地與客體（待測物）結合，並引起探針所處的化學或生物微環境發生改變。

2. 信號發射基團（Fluorophore）：把識別基團與待測物結合所引起的化學或生物微環境變化轉變為人易感知（顏色變化）或儀器易檢測的信號（熒光等）。小分子熒光探針一般使用有機小分子熒光團，常見的包括：蔥（Anthracene）、香豆素（Coumarin）、熒光素（Fluorescein）、氟硼類染料（BODIPY）、萘醯亞胺（Naphthalimide）、苯丙噁二唑（NBD）、羅丹明（Rhodamine）、川菁類染料（Cyanine）等。它們的衍生物發射波長範圍幾乎包含所有可見光區域（400-800 nm），通過對這些熒光團進行適當修飾可實現從藍光、綠光到紅光、近紅外光（650-900 nm）區域的覆蓋。另外，發光量子點、上轉換納米材料、高分子聚合物熒光材料、熒光蛋白等也可以作為熒光探針中的信號基團。

3. 連接基團（Spacer）：將熒光團和識別基團連接起來，使識別信息有效地轉化為熒光信號（如熒光強度的變化、熒光光譜的移動、熒光壽命的改變等），從而實現對待測物的有效檢測。並不是所有探針都有連接基團。

七、熒光探針可以檢測的生物體內物質

1. 質子（H+）

2. 自由基等活性氮、氧物種（ROS, RNS）

3. 氣體信號分子（NO, CO, H2S等）

4. 重金屬污染（Cd2+. Hg2+.Pb2+等）

5. 陰離子（Cl-, HCO3-,H2PO4- ,HPO42-等）

6. 過渡金屬離子（Fe2+/Fe3+,Zn2+, Cu+/Cu2+等）

7. 鹼金屬及鹼土金屬離子（K+, Na+, Ca2+,Mg2+）

8. DNA、RNA和蛋白質等生物大分子

9. 多肽、葡萄糖、麥芽糖等有機小分子

八、熒光探針的種類

根據與客體作用後熒光信號的變化，可分為強度變化型熒光探針和比例計量型熒光探針，其中強度變化型探針又分為猝滅型（ON-OFF）和增強型（OFF-ON）熒光探針。

強度變化型熒光探針根據熒光強度的變化來實現對客體物種的檢測。由於熒光強度還會受到探針濃度、激發光源效率、探針所處環境等其他因素的影響，這類探針在對客體物種進行定量檢測方面也有明顯的局限性。猝滅型（ON-OFF）熒光探針自身具有較強的熒光，與被測物發生作用後，熒光減弱或者消失，在檢測一些能猝滅熒光的物種（Cu2+, Hg2+等）時有一定的應用價值。但是，由於氧氣等其他因素也可能引起熒光猝滅而發生誤檢。增強型（OFF-ON）熒光探針本身沒有熒光或只發出很弱的熒光，在與客體作用之後熒光增強。相對於猝滅，熒光增強的信號變化更易有效檢測，而且探針自身的熒光弱，可以降低背景信號，提高探針的靈敏度。目前大多數的熒光探針都屬於增強型熒光探針。

比例計量型熒光探針自身也發出一定波長的熒光。與強度變化型熒光探針不同的是，在與被測物種作用之後，探針的發射波長發生移動（紅移或藍移）。其明顯優勢在於可通過兩個波長下熒光強度的比值來消除大部分環境因素的干擾（即自校正），從而在探針濃度未知的情況下實現對被測物種的定量檢測。這類探針設計的難點在於缺乏有效實現波長移動的設計策略。同時，如何使響應前後兩個發射峰之間的距離儘可能的大，減少發射光譜之間的重疊，以提高探針響應的靈敏度，也是該類探針設計的重點。

根據識別基團與客體的響應類型，熒光探針可分為配位型（又稱鰲合型）熒光探針和反應型熒光探針（Chemodosimeter）。除此之外，還有專用熒光探針，如離子通道熒光探針、受體熒光探針、線粒體標記探針等。

配位型熒光探針與客體物種通過配位作用結合，使得結合前後探針的熒光性質發生改變。由於配位作用一般是可逆的快速過程，這種類型的探針的突出優勢是可以實現對被分析物的可逆檢測，實時跟蹤被分析物種在生物樣品中的微小的變化，特別適用於對生物體內各種金屬離子的檢測。此外，可以通過增減配位原子的個數等途徑，調節探針與被測物的配位能力，便於根據實際需要設計不同線性響應範圍的熒光探針。由於生物體內同時存在不同濃度的多種金屬離子，會與目標金屬離子發生競爭配位作用，這就需要對配位基團進行精巧的設計來排除性質相似的其他金屬離子的干擾。

反應型的熒光探針是通過與被測物種發生的不可逆化學反應，改變探針的熒光性質，從而實現對被測物種的響應。這類探針的優勢在於，有許多特異性的化學反應可以用於探針的設計，因此基於這些特異的化學反應的熒光探針通常具有較好的選擇性。另外，一些具有猝滅效應的物種（Cu2+, Hg2+等）與這類探針發生反應後，一般會脫離探針，探針從無熒光的分子變為熒光分子。這就克服了配位型熒光探針熒光易猝滅的缺點。此類探針還被廣泛運用於生物體內活性物種（ROS, RNS等）的檢測。設計這類探針的難點在於如何提高探針的選擇性。

九、熒光探針的設計機制

傳統的分子探針設計原理包括光致電子轉移（Photoinduced Electron Transfer,PET）、分子內電荷轉移（Intramolecular ChargeTransfer, ICT）、扭曲的分子內電荷轉移（Twisted IntramolecularCharge Transfer, TICT)，金屬一配體電荷轉移（Metal to Ligand ChargeTransfer, MLCT），電子能量轉移（Electron EnergyTransfer, EET）、熒光共振能量轉移（Fluorescence ResonanceEnergy Transfer, FRET）、激發態分子內質子轉移（Excited-StateIntramolecular Proton Transfer, ESIPT）、激發態締合物/激發態複合體的形成（Excimer/Exciplex Formation）等。新興機理包括聚集誘導發光（Aggregation InducedEmission, AIE）、上轉換髮光（Upconversion Luminescence,UCL）等。

十、光致電子轉移（PET）

一般而言，光誘導電子轉移（PET）過程分為兩種類型。一種是電子從電子給體轉移到激發態的熒光團（電子受體），激發態熒光團被還原導致熒光猝滅，此即a-PET（a指acceptor）或reductive-PET；另一種是電子從激發態的熒光團（電子給體）轉移到電子受體，激發態熒光團被氧化導致熒光猝滅，此即d-PET（d指donor）或oxidative-PET。沒有結合客體時，熒光團和受體之間的PET將熒光猝滅；結合客體後，PET過程受到抑制，熒光團發射熒光。

前線分子軌道理論可以用來解釋PET過程。熒光探針分子的受體部分（Receptor）在結合客體之前，其HOMO 軌道上的電子會向激發態熒光團HOMO軌道上轉移，使熒光團LUMO軌道上的激發態電子不能返回基態而導致熒光猝滅，此即a-PET；當受體上有可以接受電子的空軌道時，熒光團被激發到LUMO軌道上的激發態電子可直接轉移到受體的空軌道上，然後經過再次電子轉移恢復到熒光團被激發前的狀態，同樣導致熒光猝滅，此即d-PET。受體結合客體之後，其軌道能級發生變化，受體HOMO軌道上的電子無法轉移到熒光團的HOMO軌道上，或者熒光團LUMO軌道上的電子無法轉移到受體的空軌道上，PET過程受阻，此時，熒光團的激發態電子可以返回基態，產生熒光。

PET機理通常用於設計增強型熒光探針，其識別基團通常含有N、O等有孤對電子的原子，通常通過配位作用與被測物（大多為金屬離子）結合。因此PET熒光增強又稱作配位增強熒光（Chelation-Enhanced Fluorescence,CHEF）。但是PET探針只能檢測Zn2+、Cu+（均是3d104s0）等閉殼層結構的離子，因其不存在單電子順磁性，不會猝滅熒光；Cu2+、Fe2+、Fe3+等離子因存在單電子而表現出順磁性；Hg2+存在重原子效應，四者與熒光團配位後均將導致熒光猝滅。因此檢測這些離子的PET探針非常少見。

二茂鐵（Ferrocene,Fc）具有很好的可逆氧化還原性質及穩定性，因此常被用作電子中介體跟熒光團共價連接。富電子的Fc單元以PET原理猝滅熒光團的熒光，當被氧化失去電子後PET過程被打斷，熒光團的熒光恢復，被還原之後熒光又被猝滅，此過程可以循環進行。

十一、分子內電荷轉移（ICT）

分子內電荷轉移又叫做光致電荷轉移（Photo-induced Charge Transfer, PCT），也是設計比例計量型熒光探針的重要手段。這類熒光探針的識別基團與熒光團直接相連，也可以理解為組成熒光團的某些原子或基團直接參与對客體的識別。這些探針的熒光團骨架兩端分別連接相互偶合的給電子基團（Donor, 記作D）和吸電子基團（Acceptor, 記作A），因此分子內部存在著由給電子基團向吸電子基團的電荷轉移過程，這個過程就叫分子內電荷轉移。ICT效應誘導的熒光也叫做ICT發射。

探針分子中給電子基團的給電子能力或者吸電子基團的吸電子能力越強，ICT效應就越強，ICT峰的波長就越長，通常情況下熒光強度也會增強。相反，探針中給電子基團的給電子能力或者吸電子基團的吸電子能力越弱， ICT效應就越弱，ICT發射峰的波長越短，熒光強度越弱。

當被測物與探針的吸電子基團（A）結合時，金屬離子配位作用增強了吸電子基團的吸電子能力，ICT加強，基態和激發態的能級差減小，波長紅移。當被測物與探針的給電子基團（D）結合時，金屬離子的配位作用減弱了給電子基團的給電子能力，ICT減弱，基態與激發態之間的能級差增大，波長藍移。

ICT機理的熒光探針彌補了PET機制在設計比例計量型探針方面的不足，但基於ICT機理的比例計量型探針存在一些亟待解決的問題。為實現理想的比例計量效果，客體分子誘導ICT探針的發射峰需要足夠大的移動距離，儘可能減小與自由探針發射峰的重疊，這意味著響應前後ICT效應須有較大變化。然而在實際操作中，ICT發射峰常較寬，響應前後兩發射峰重疊嚴重。其二，由於識別基團通常含有多個帶有孤對電子的原子（如N, O, S等），它們會產生PET效應猝滅熒光。與客體配位後，它們的PET效應會減弱或消失，致使熒光紅移或藍移的同時伴隨熒光增強，即新發射峰將完全覆蓋舊發射峰，無法實現比例計量檢測。其三，ICT變化過大又會引起熒光強度的顯著變化，只能得到強度變化型的熒光探針。因此，並不是所有的ICT機制的熒光探針都能實現對客體的比例計量響應。解決這個難題需要對探針的熒光團和識別基團進行精細的選擇和設計，但目前還沒有十分成熟的設計策略。

十二、熒光共振能量轉移（FRET）

熒光共振能量轉移（FRET）是能量轉移（ET）的一種。能量轉移是指分子內能量從供體生色團轉移到受體生色團的過程。可根據能量供受體間相互作用的距離將ET分為電子能量轉移（EET）和熒光共振能量轉移（FRET）。EET又叫Dexter電子轉移，它需要供體與受體之間的距離小於10?。FRET又叫Forster共振能量轉移，它的發生需要滿足三個條件：供體的發射光譜與受體的吸收光譜有一定程度的重疊；能量供受體之間必須足夠接近，約10-100?；供體與受體的偶極矩取向滿足一定的條件（即按一定方式排列）。FRET效率常通過調節光譜重疊度和供受體間距改變。

FRET對供受體間距有很強的依賴性，它不僅可以用來設計增強型熒光探針，而更大的優勢在於可以方便地設計比例計量型熒光探針。基於FRET機制的熒光探針同時含有兩個生色團，它們通過一定長度的隔離基團相連成為一個整體，而兩個生色團和隔離基團都可以作為與客體作用的識別基團，實現對體系中FRET效率的調節，改變兩個發射峰強度的比例。

對增強型熒光探針而言，由於隔離基團是盤曲摺疊的長鏈（如DNA單鏈），能量受體與熒光團相互接近，發生FERT，熒光猝滅。探針與客體作用之後，通過改變受體的吸收光譜（客體與受體作用）或者增加供體與受體之間的距離（客體與間隔基團作用，如間隔DNA與客體DNA結合形成剛性雙鏈，不再盤曲摺疊），可以降低甚至消除體系內的FRET過程，供體受到激發後能量不再轉移給受體，而以熒光的形式發射出來，致使體系與被測物作用後熒光顯著增強。

對比例計量熒光探針而言，作為能量受體的生色團也是熒光團，它的吸收光譜與供體的發射光譜有較好的重疊，且與供體的距離合適，體系內的FRET效率較高，供體受到激發後將能量轉移給受體，使受體激發而發出受體的熒光。當探針與被測物作用後，使得體系中供體與受體的光譜重疊降低或兩者距離增大時，FRET效率降低或者被完全阻斷，供體受到激發後能量不能傳遞給受體，發出供體自身的熒光。由於供體和受體的發射光譜不同，就可以實現探針在與客體作用前後兩個發射峰比例的明顯改變。利用FRET機制設計的比例計量熒光探針可以通過合理選擇供體和受體熒光團，保持響應前後兩發射峰的較大間距，使其不存在明顯重疊，有利於比例計量檢測。因此，FRET機制可有效彌補ICT機制在設計比例計量型熒光探針中的不足。

十三、激發態分子內質子轉移（ESIPT）

ESIPT 現象是指化合物分子由基態躍遷到激發態後，分子內某一基團上的氫核（即質子）通過分子內氫鍵轉移到分子中鄰近的N、S、O等雜原子上，形成相應的互變異構體的過程。相比於一般的有機發光化合物，ESIPT化合物具有其獨特的E-E*, E*-K*, K*-K, K-E四能級躍遷。其中E和E*分別代表醇式（enol）結構的基態與激發態，K和K*則分別代表酮式（keto）結構的基態與激發態。通常，ESIPT化合物在基態下以醇式結構穩定存在（E），而在激發態時則以酮式結構（K*）穩定存在。

在ESIPT體系中，激發態的活性質子以不同的速度離開或與一個處於基態的分子相結合。相對於電子轉移，ESIPT是一個快速的過程，約在幾分之一皮秒到幾十皮秒之間。由於ESIPT分子中分別存在兩個異構體的基態和激發態，構成4個能級循環，可以形成兩個不同的發射帶，因而受到了廣泛關注。最為典型的例子是2』-羥基苯基-2-苯並噁唑。

ESIPT過程很容易從熒光光譜上區別出來：。ESIPT染料的吸收光譜與母體發色團類似，而熒光光譜卻發生顯著紅移，即吸收光譜和發射光譜幾乎不重疊，斯托克斯位移很大，這使ESIPT染料常通過與金屬結合、羥基的保護與去保護等原理分別設計成檢測陽離子與陰離子的比例計量型熒光探針。

十四、激發態締合物/激發態複合物的形成（Excimer/ExciplexFormation）

激發態締合物（Excimer,簡稱Er）可以被定義為由一個激發態的熒光團和相同結構的基態熒光團相互作用形成的締合物。類似的，如果處於激發態的熒光團與處於基態的結構不同的熒光團形成複合物，就叫做激發態複合物（Exicplex, 簡稱Ex）。與單體分子相比，Er（或Ex）的發射光譜發生紅移，而且常能同時觀察到來自單體和Er（或Ex）的發射峰。

蒽（anthracene）和芘（pyrene）等熒光團容易形成Er。當某有機小分子含有兩個這樣的熒光團，且相互之間的距離可以被某個金屬離子的配位作用調節時，此有機小分子就有可能對這個金屬離子進行比例熒光識別。也就是說，金屬離子可誘導熒光探針中的Er（或Ex）的形成或解離，因此可用單體與Er（或Ex）的發射峰強度比值的變化來檢測該金屬離子。識別基團通常包括冠醚、環糊精、杯芳烴等含有多個配位原子的基團。與金屬離子配位之後，這些集團的構型常發生較大變化。

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