會發光的蛋白：錢永健應該得諾獎嗎？

?錢永健（1952-2016）

編者按：

9月1日美國加州大學聖迭戈分校傳出一則消息無疑讓華人科學界一片驚愕。著名華裔科學家、2008年諾貝爾化學獎得主錢永健於2016年8月24日辭世，享年64歲。加州大學聖迭戈分校的訃告上寫道：「錢永健教授的工作照亮了科學」。的確，在綠色熒光蛋白的發現、表達與開發的40餘年時間裡，錢永健的改造之功，讓這種生物標記技術光芒更亮，照進生命的深處，並得到了極大的普及，如今發表的生物醫藥領域科研成果有一半以上都用了這一技術。北京大學科技史教授周程就綠色熒光蛋白的發現歷程作了深入考察，還原了一段跌宕起伏的科學發現史。那些為這一科學發現做出傑出工作的人們，未必都有機會分享諾獎的榮耀，但是因為這一照耀古今的發現，他們共同擁有一段傳奇的人生，並且終將流傳下去。

撰文 | 周程（北京大學哲學系暨科學與社會研究中心教授）

責編 | 李曉明

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引言

20世紀後期，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為代表的一系列生物熒游標記材料的發現與應用，為生物學的大發展提供了一種全新的工具。自此之後，科學家們似乎練成了火眼金睛，能夠很方便地觀察活細胞的細微結構和生理過程，為深入研究腦細胞的發育過程以及癌細胞的擴散方式等打下了良好的基礎。

?綠色熒光蛋白（GFP）的形狀就像一個圓柱體。來源：聖迭戈大學錢永健實驗室

GFP無需依賴熒光素酶或其他輔助因子的作用，就可以在生物體內每一個被表達的細胞中「自動」出現。而且，GFP的熒光非常穩定,在激發光照射下，其抗光漂白能力比熒光素強很多。是故，GFP及其變種今日被廣泛地用作分子標記。此外，GFP還被用作砷和一些重金屬的感測器。正因為如此，瑞典皇家科學院決定將2008年的諾貝爾化學獎授予對GFP的發現、表達和開發做出了傑出貢獻的三位科學家：下村修(Osamu Shimomura,1928-)、馬丁·查爾菲(Martin Chalfie,1947-)和錢永健(Roger Yonchien Tsien,1952-2016)。

實際上，從綠色熒光蛋白的發現到熒光蛋白標記法的發明應用，過程相當複雜。可以說，如果沒有眾多科學家接力推進，使之成功穿越橫亘在發現與發明之間的「亞馬遜叢林」，熒光蛋白標記法就不可能獲得普及。

本文依據研發參與者寫的回憶文章和發表的論文對GFP分子的發現、基因的複製與表達、突變體的開發與應用、類似體的篩選與改進等研發關鍵環節作更為深入的考察，以期能夠較為全面地揭示熒光蛋白標記法的誕生經緯，從而加深人們對錢永健獲諾貝爾獎一事的理解。

?在GFP發現和普及過程中的幾個關鍵人物。其中下村修，查爾菲和錢永健獲得2008年諾貝爾化學獎。

下村修：瞥見污水池裡躥出來一道藍光

GFP革命的種子是由下村修於1962年埋下的。但是，下村當時並沒有料到，自己不經意間發現的GFP後來竟成了科學家們深入揭示生命活動奧秘的一個非常重要的工具。

下村修的中學時代是在戰亂中度過的。戰後初期，他在長崎醫科大學（長崎大學前身）附屬藥學專科部接受了三年的高等教育，畢業後留校任分析化學實驗室實驗指導教師。1955年，下村被選派到名古屋大學理學院化學系天然有機化學研究室進修。報到當天，其指導教授就把一個裝滿乾燥海螢(Cypridina hilgendorfri)的真空防潮容器拿給他，希望能將發光海螢體內的熒光素提取出來並獲得結晶，以便為最終確定熒光素的分子結構奠定基礎。

海熒熒光素遇到氧氣後很快就會分解，因此這項工作難度極大，以致普林斯頓大學哈維(Newton Harvey,1887-1959)教授帶著學生幹了好多年仍未取得成功。可是這一難題卻因下村的一項意外發現而被解決了。

下村修的工作引起了哈維的弟子——普林斯頓大學生物學系教授約翰遜(Frank Johnson,1908-1990)的注意，他盛情邀請剛被名古屋大學破格授予理學博士學位的下村於1960年9月來到普林斯頓，開始從事為期三年的博士後研究。

每到夏季，在美國西北海岸的星期五港灣都可看到成群的多管水母(Aequorea victoria)，但是人們不知道這種無色透明的水母為什麼會發出綠光。約翰遜建議二人間的合作研究就從這種水母入手。由於提取純化多管水母體內的發光物質看似與自己先前的研究跨度不大，下村欣然接受了這一提議。

?下村修在演講中展示的水母圖片，其中下左圖為日光狀態、下右圖為黑暗中狀態。來源：下村修PPT

1961年夏，下村修如約跟隨約翰遜來到華盛頓大學的星期五港灣研究所。沒有料到的是，多管水母的發光機理好像和海螢的完全不同，無論他和約翰遜採用哪一種降低熒光素酶活性的方法或去氧措施，都無法讓多管水母發光物質提取液停止發光。在無法說服約翰遜放棄原定研究方案的情況下，下村不得不獨自行動。

經過數周的苦苦探索後，下村突然意識到：多管水母體內的發光物質很有可能是蛋白質，若確實如此，則可通過改變提取液的pH值來降低蛋白質的活性，進而遏制發光物質發光。之後的實驗證明下村的判斷是正確的。富有戲劇性的是，當下村做完實驗把含有多管水母發光物質的溶液倒進污水池時，突然躥出一道藍光。當時，正巧有人往污水池裡排放海水。於是下村推定，引起發光的主因極有可能是海水中的鈣離子。這意味著可以通過降低提取液中的鈣離子濃度來阻止發光物質發光。實際上，有效遏制多管水母發光物質發光的難題後來就這麼簡單地解決了。

1961年9月，在星期五港灣辛苦工作了三個多月的約翰遜和下村等人帶著冷凍多管水母發光物質提取液回到了普林斯頓。第二年春，他們提取到了5毫克高純度多管水母發光物質，對其進行分析後發現，該發光物質確實是一種蛋白質，加微量鈣離子後會發藍光，而且在真空狀態下也能發光。下村等人將這種特殊蛋白質命名為「aequorin」，即水母素。在純化水母素過程中，下村等人還發現了一個副產品——一種含量很低、在自然光的照射下發淺綠色熒光的新型蛋白質。在該年投給《細胞和比較生理學學報》的論文腳註中，下村等人首次公開了這項發現。當時，他們將這種新型蛋白質稱為「綠色蛋白質」。

?加微量鈣離子後會發藍光的「綠色蛋白質」。來源：下村修PPT

儘管下村和約翰遜等1962年就發現了多管水母「綠色蛋白質」，但是他們當時還顧不上對這種物質的生化性質展開深入的研究，再說他們當初積攢的「綠色蛋白質」數量有限，根本滿足不了實驗最低需求。當時，下村和約翰遜最為關心的是，既然水母素對鈣離子非常敏感，那麼可否利用它的這一特性來測定血清和牛奶中的鈣離子含量？1963年初，他們把自己在這方面所做的研究整理成文，美國的《科學》雜誌同年6月刊發了該文。

1963年，35歲的下村修回到日本，就任名古屋大學水質科學研究所副教授。因其對生物發光研究情有獨鍾，在魚和熊掌不可兼得的情況下，他於1965年底辭去待遇優厚的日本國立大學的教職，帶著夫人和一歲的兒子返回普林斯頓，在約翰遜研究室當起了依靠申請研究經費過活的研究員。上個世紀六十年代後期，下村急於探明的主要是水母素的化學結構與發光機理。為獲得足量的水母素，他每年夏天都要帶上家人到星期五港灣去大量捕撈多管水母。雖然非常辛苦，但他樂此不疲。在大量提取水母素的過程中，他也積攢了不少多管水母「綠色蛋白質」，不過他當時並未對其展開實質性的研究。

?從1960年代開始，下村(上圖後面站立的小夥子)在他的家人和朋友幫助下在太平洋沿岸採集可以在黑暗中發光的水母(下圖)。來源：諾獎網站、http://ecoxotic.com

1969年，哈佛大學的伍迪·哈斯廷(Woody Hasting,1927-) 和詹姆斯·莫林(James Morin,1953-)在研究腔腸動物發光蛋白質特性時再次「發現」了多管水母「綠色蛋白質」，並將其命名為「Green Fluorescent Protein」，即綠色熒光蛋白。

二人在研究過程中還注意到，水母素遇到鈣離子後發出來的光是藍色的，而多管水母受到刺激後發出的卻是綠光。此後，水母素髮出的藍光是怎樣轉變成綠色的，GFP在中間發揮了什麼樣的作用之類問題便一直縈繞在他們的腦海里。

1971年，他們提出了熒光共振能量轉移理論(FRET)，對這類現象進行了解釋。依據該理論，水母素生產的藍光先以無輻射的方式傳遞給了GFP，GFP受到藍光激發後再以發綠光的方式將能量釋放出來。產生熒光共振能量轉移必須滿足兩個條件：(1)供體的發射波長和受體的吸收波長重疊；(2)供體和受體的距離小於3納米。

1974年，下村等人使用自己提純的水母素和多管水母GFP首次驗證了這一理論。

由於水母素分子的發光機理已於1973年被解明，這樣多管水母的發光機理問題於1974年被解決之後，弄清GFP分子的發光機理便成了當務之急。糟糕的是，下村等人多年積攢起來的多管水母GFP被約翰遜帶去參加學術會議時丟失了。而當時的生物技術還不甚發達，做一次GFP結構分析實驗需要上百毫克的GFP。所以，此後數年下村不得不仍舊帶著家人去星期五港灣大量捕撈多管水母。由於多管水母中的GFP含量遠低於水母素，故直到1979年下村才攢足100毫克GFP。是年，下村他們把手中的多管水母GFP全部酶解成肽段，然後逐一檢查這些肽段的光反應情況。結果發現，這些肽段均不發光，像GFP一樣吸收光的也只有一段。對純化後只有0.1毫克的這片肽段展開深入研究後，下村驚奇的發現其吸收光譜峰值和自己20年前在名古屋大學研究海螢熒光素時合成出的化合物的吸收光譜峰值非常接近。於是他很快就推測出了多管水母GFP發光基團的化學結構，並在《歐洲生物化學學會聯盟通訊》上公開了這一研究成果。

此後不久，下村獲知剛從喬治亞大學轉到羅格斯大學就任教職的威廉?瓦德(William Ward)也在星期五港灣大量捕撈多管水母，並已重點展開了對GFP的研究。經過一番分析，對基因工程興趣不是很濃的下村決定專註於當時被認為有著廣泛應用前景的水母素的研究，不再參與GFP的研究開發競爭。

?2008年12月10日在斯德哥爾摩音樂廳，剛領完諾貝爾獎的下村修。來源：諾獎網站

普拉舍：與諾獎擦肩而過，淪落成班車司機

1981年，下村修轉到位於馬薩諸塞州伍茲霍爾(Woods Hole)的海洋生物學實驗室就任資深科學家，同時兼任波士頓大學藥學院教授。六年後，在喬治亞大學跟隨密爾頓·考彌爾（Milton J. Cormier,1948-）教授搞了多年水母素克隆研究的道格拉斯·普拉舍(Douglas Prasher,1951-)也來到海洋生物學實驗室。在這裡，普拉舍成功地從多管水母的DNA中分離出了GFP基因，並對其進行了複製與測序，為GFP在異源生物體中的表達奠定了重要的基礎。

普拉舍1979年在俄亥俄大學取得生物化學博士學位後，到喬治亞大學跟隨細菌遺傳學家悉尼·庫斯納（Sidney Kushner）教授做了一期博士後研究。在此期間，普拉舍結識了該校的生物化學系創始人考彌爾。考彌爾1958年調入喬治亞大學後，便開始迷上了一種大量生活在喬治亞的淺水海灣里、受刺激後能發出綠光的群體無脊椎動物——海腎(Renilla reniformis)。在其指導下，1977年，一名研究生成功地分離出了海腎螢光素酶；緊隨其後，一名博士後又提取到了海腎GFP。1979年，考彌爾和其指導的博士後瓦德聯名發表的有關海腎GFP特性的那篇著名論文就是在此研究基礎上形成的。當時的研究表明，海腎與多管水母的發光機理非常相似，但也存在不少差別。為加深對動物發光現象的理解，考彌爾決定做一些有關海腎與多管水母發光機理的比較研究。是故，進入八十年代後，考彌爾把多管水母也列作自己的重點研究對象。由於對生物發光研究產生了濃厚興趣，普拉舍完成一期博士後研究後，就轉至考彌爾門下，開始從事水母素的克隆研究。

如眾所知，上個世紀七十年代初，重組DNA研究在美國取得重大突破，基因技術獲得了快速發展，以致進入八十年代後發達國家的不少實驗室陸續掌握了使用微生物大量表達外源蛋白質這項前沿技術。考彌爾實驗室可謂是其中的一名佼佼者。在考彌爾的指導下，普拉舍和實驗室技術員麥坎(Richard O. McCann)合作，於八十年代初就確定了水母素基因在多管水母DNA中的位置。此後，他們再接再厲，又成功地實現了脫輔基水母素（apoaequorin）基因在大腸桿菌中的表達。脫輔基水母素在有氧環境下用腔腸素(coelenterazine)進行處理後可轉化為能夠發光的水母素，這意味著此後科學家們無需再去美國西北海岸捕撈多管水母就可以大量製取水母素。1985年2月，普拉舍等人公開發表了這一研究成果。遵照考彌爾的建議，普拉舍隨後又啟動了多管水母GFP基因的分離與複製研究。因瓦德等人此前已對多管水母GFP的組成結構與生化特性展開了一系列探索，故普拉舍以此為基礎很快就獲得了一個多管水母GFP基因片段的拷貝。後因普拉舍轉赴伍茲霍爾就任新職，此項研究被暫時擱置。

1988年，也即在獲聘擔任海洋生物學實驗室助理研究員的第二年，普拉舍獲得了美國癌症協會提供的為期三年、金額超過20萬美元的研究資助，於是他按照資助協議在伍茲霍爾重新啟動了GFP基因的分離與複製研究。毋庸贅言，此項研究是同考彌爾等人合作進行的。儘管此前已獲得了一個多管水母GFP基因片段的拷貝，但它只含有168個氨基酸，而多管水母的GFP是由238個氨基酸組成的，這意味著分離出來的GFP基因片段少了30%的密碼子。為獲取完整的GFP基因，普拉舍再次遠赴星期五港灣捕撈了一批多管水母，並用液氮對其進行了速凍處理。返回伍茲霍爾後，普拉舍將從多管水母中提取的DNA酶切成了140萬個片段。普拉舍原以為這些DNA片段中含有GFP基因的怎麼也有成百上千個，可是逐個檢測後發現，只有一個片段含有GFP基因。幸運的是，費盡千辛萬苦分離出來的GFP基因是一個完整的GFP基因。之後，普拉舍使用細菌的質粒作載體對GFP基因進行了大量複製，並確定了多管水母GFP的基因序列。1991年3月，他把這項研究成果整理成文，投給了《基因》雜誌。次年2月《基因》正式刊發了這篇論文。不過，普拉舍並沒有實現GFP基因在異源生物體中的表達。

實際上，早在1987年，普拉舍就產生了用多管水母GFP做示蹤分子來研究細胞內蛋白質活動情況的想法。這主要是因為：

(1)細胞中的蛋白質太小，用最先進的電子顯微鏡也無法觀察到。如果能把多管水母GFP和目的蛋白質連在一起，它無異於在目的蛋白質上裝了一個燈泡，人們可以通過觀察GFP的熒光來了解目的蛋白質的活動情況。

(2)下村修多年前就已揭示多管水母GFP是一種非常小的蛋白質，將小蛋白質連接到比較大的目的蛋白質上去一般不會對目的蛋白質的功能產生影響。不過，普拉舍以為，多管水母GFP發光基團的形成有可能需要體內輔助因子或外源反應底物提供幫助。因為當時的研究表明，即使是在有氧環境下，從生物體中提取的發光物質，如水母素、熒光素等都不可能單獨發光。這意味著除非多管水母GFP是一個例外，否則人們很難實現其在異源生物細胞中的表達，也即不太可能在其他生物體中觀察到多管水母GFP發出的熒光。

由於對GFP基因在其他生物體中的表達缺乏信心，故普拉舍在美國癌症協會資助的科研經費告罄前都沒有將其用GFP做示蹤分子的想法完全付諸實施。當他下決心啟動GFP基因表達研究，並向美國國立衛生研究院等機構申請有關資助時，卻遭到了無情的拒絕，以致他不無遺憾地將揭開GFP革命序幕的機會拱手讓給了別人。不過，用細菌的質粒大量複製GFP基因技術的掌握，使普拉舍等人得以更方便地對GFP發光基團的結構展開深入研究，以至1991年普拉舍和瓦德等人用實驗驗證了下村修1979年提出的有關GFP發光基團化學結構的主要推測，同時提出了不少有關GFP發光基團分子結構與發光機理的新見解。這些研究成果1993年發表在《生物化學》雜誌上了。

申請多管水母GFP基因表達研究資助遭拒後，普拉舍接受了美國海軍研究辦公室的資助，開始開發與水銀之類重金屬相遇後旋即發光的水母素變種。此後，普拉舍因未能通過海洋生物學實驗室的終身職位評審而不得不先後轉至美國農業部所屬的奧的斯植物保護中心、植物遺傳資源與生物技術實驗室，美國宇航局旗下的AZ技術公司等機構從事與GFP無甚關聯的研究。不斷拋棄先前的研究積累，展開全新的研究，要做出一番業績談何容易！加上時運不佳，以致普拉舍後來落魄時不得不跑到豐田汽車專賣店當起了班車駕駛員。

?司機普拉舍。來源：http://nytimes.com。

查爾菲：揭開GFP革命的序幕

普拉舍放棄開展多管水母GFP基因在異源生物細胞中的表達研究時，應哥倫比亞大學從事線蟲觸覺神經研究的馬丁·查爾菲教授的請求，將含有多管水母GFP基因的質粒提供給了查爾菲。此後，查爾菲和他的研究生合作，成功地實現了多管水母GFP基因在大腸桿菌和線蟲中的表達，從而揭開了GFP革命的序幕。

查爾菲1977年在哈佛大學獲生理學博士學位後，決定接受學友羅伯特·霍維茨(H. Robert Horvitz,1947-)的建議，赴英國劍橋大學跟隨悉尼·布倫納(Sydney Brenner,1927-)教授從事博士後研究。布倫納六十年代初期和DNA雙螺旋結構發現者之一克里克(Francis Crick, 1916-2004)合作解釋了蛋白質翻譯的三元碼問題之後，開始另闢蹊徑專註於秀麗隱桿線蟲研究。他用這種身長僅一、兩個毫米的透明線蟲作模式生物，和其學生合作開展了一系列發育生物學研究。因在揭示器官發育和細胞程序化凋亡的遺傳調控機理方面做出了創造性的貢獻，他和兩名學生——霍維茨、蘇爾斯頓(John E. Sulston, 1942-)一起被授予2002年度諾貝爾生理或醫學獎。在跟隨布倫納研究線蟲期間，查爾菲對這種體細胞總數不到1000，壽命不超過4天，但在生理上與人體有著眾多相似之處的線蟲產生了濃厚的興趣，以致1982年到哥倫比亞大學就任教職後一直把線蟲作為其主要研究對象。

?查爾菲。來源：哥倫比亞大學

上個世紀八十年代中期，查爾菲在研究線蟲細胞中的基因和基因啟動子的作用機理時，只能使用具有糖解作用的β-半乳糖苷酶基因作標記，即將其連接在目的基因或基因啟動子後面。採用這種方法存在一個問題，那就是最終必須把線蟲殺死，否則無法深入了解線蟲細胞內的基因或基因啟動子的活動情況。1988年初，在哥倫比亞大學舉辦的一個以發光生物為主題的討論班上，查爾菲獲悉人們已從多管水母身上提取到了一種叫做GFP的熒光物質。他當即意識到可以嘗試著使用這種熒光物質的基因作報告基因，以解決自己在研究線蟲細胞過程中遇到的諸多難題。經過數日的調查，查爾菲了解到普拉舍正在從事多管水母GFP基因的分離與複製研究。於是他與普拉舍取得了聯繫，並提出希望合作開展多管水母GFP基因在線蟲中的表達研究。當時，普拉舍只解讀完了一個不完整的多管水母GFP基因的鹼基對，故談不上和查爾菲開展相關合作研究。1992年初，普拉舍解讀完多管水母GFP基因的全部鹼基對後打電話通知查爾菲時，不巧查爾菲正在猶他大學度婚假，因此雙方沒能聯繫上。普拉舍當時誤以為查爾菲已經離職了。

1992年9月，一直沒有收到普拉舍分離多管水母GFP基因取得成功消息的查爾菲與研究生奧伊斯基興(Ghia Euskirchen)討論制定了一份有關使用GFP基因研究透明線蟲的計劃。他們在進行文獻檢索時發現，普拉舍和考彌爾等半年前在《基因》雜誌上合作發表了一篇有關多管水母GFP一級結構的論文。在這篇文章中，普拉舍等人報告了他們從事多管水母GFP基因分離、複製與測序研究所取得的進展，不過在文章的末尾，他們把自己複製出的GFP稱作為脫輔基GFP。言下之意是這種蛋白質不含發光基團，尚不能發光。儘管如此，查爾菲還是滿懷希望地聯繫上了普拉舍，並獲得了普拉舍提供的含有多管水母GFP基因的質粒。

收到含有多管水母GFP基因的質粒之後，查爾菲便指示奧伊斯基興使用剛剛興起的聚合酶鏈式反應(PCR)技術擴增GFP基因，然後再用大腸桿菌做GFP基因表達實驗。在查爾菲看來，無論這項實驗成敗與否，它對研究生來講都是一次很好的鍛煉。經過一個月的努力，奧伊斯基興終於在顯微鏡中觀察到了大腸桿菌體內發出的綠光。這意味著多管水母GFP無需任何輔助因子和反應底物，就可以自行形成發光基團。這項研究使查爾菲深受鼓舞。

查爾菲此前從未接觸過多管水母GFP基因，而且其實驗室里並未配備與熒光蛋白研究有關的專用儀器設備。在這種情況下，向美國國家科學基金會等機構申請GFP基因表達研究資助很難通過同行評審，即使僥倖通過了，那也是半年後的事。深諳科技界競爭規則的查爾菲沒有去緣木求魚，他果斷地決定先用自主經費啟動多管水母GFP基因在更為複雜的生物體——線蟲中的表達研究。當克服重重困難把多管水母GFP基因插入線蟲目的基因及其啟動子之間後，他們在線蟲的神經細胞內觀察到了多管水母GFP發出的熒光，並確認多管水母GFP對線蟲神經細胞無毒副作用。1994年2月，美國《科學》雜誌刊發了這一里程碑性的研究成果，並在封面上刊登了查爾菲提供的帶有多個綠色熒光點的線蟲配圖。　

?發表查爾菲論文的那期《科學》雜誌封面

其實，當時其他團隊大都未能在異源生物體上觀察到GFP發出的熒光。很多從事生物發光研究的學者研究受挫後都以為GFP和此前發現的所有發光物質一樣需要特定的輔助因子或反應底物參與作用才能發光，因此都沒有去深究GFP基因未能在異源生物體中獲得表達是否是因剪切GFP基因時出了問題。換言之，從事生物發光研究的學者主要是從化學方面，而非從生物方面去尋找敗因。查爾菲是從事發育生物學研究的，他對生物發光研究界流行的生物體內的發光物質獨自不能發光的觀點認識有限，因此他果敢地向被生物發光研究學者認為不可能的事發起了挑戰。查爾菲團隊研究後發現，很多團隊之所以在異源生物體中觀察不到多管水母GFP發出的熒光，主要是因為他們基於普拉舍的研究，用限制性剪切酶剪切GFP基因時未將多餘的鹼基切除，以致多管水母GFP基因未能在細胞中獲得表達。

不過，1994年3月，《歐洲生物學化學會聯盟通訊》刊發了一篇與多管水母GFP基因表達有關的論文，它是由當時正在加州大學聖迭戈分校斯克里普斯海洋學研究所訪問研究的日本窒素肥料株式會社的井上敏（Satoshi Inouye）與該所的研究員、日裔學者辻(Frederick I. Tsuji)合作完成的。這是第二個在異源生物細胞中表達多管水母GFP基因取得成功的團隊。1984年，他們倆還與日本九州大學的幾位學者一起獨立地克隆出了水母素基因，但論文的發表日期比普拉舍和考彌爾的也晚了一個月。

儘管美國《科學》雜誌1994年2月刊發的查爾菲等人提交的論文正文不足兩頁，但它標誌著科學家們已打開了用GFP對活細胞進行示蹤研究的大門。十年後查爾菲也因此而榮幸地當選上了美國國家科學院院士。

?2008年12月6日、斯德哥爾摩，查爾菲在諾貝爾博物館的Satir咖啡館的一張椅子上簽字，這是諾獎得主的一項「傳統」。來源：諾貝爾博物館

錢永健的「蛋白質工具箱」

普拉舍退出GFP克隆研究前，還將其獲得的含有多管水母GFP基因的質粒無償地提供給了加州大學聖迭戈分校的錢永健。此後，錢永健對多管水母GFP的結構與功能展開了一系列卓有成效的研究，並進而開發出了一批發光效率更高，性能更加穩定，顏色更為豐富的新型熒光蛋白，為科學家們提供了一個將不同的蛋白質或細胞「染上」不同的顏色，藉以跟蹤研究其活動過程的工具箱。

出生於美國紐約的錢永健乃錢學森的堂侄。錢永健在哈佛大學獲得化學與物理學專業的學士學位後，轉赴英國劍橋大學留學。在劍橋大學，他一開始迷上了分子生物學，後來轉向海洋學，最後又轉向生理學，並於1977年獲博士學位。之後，他留在英國從事了一段時間的博士後研究。1981年，錢永健返回美國就任加州大學伯克利分校教職，1989年轉任加州大學聖迭戈分校藥理學教授以及化學與生物化學教授。

早在劍橋大學從事博士後研究期間，錢永健就發明了一種可檢測細胞內鈣離子濃度的染料。當時，測量細胞內鈣離子濃度的方法還相當原始，即便使用下村修發現的水母素，也需要將其注射到細胞內，這樣很容易對研究用細胞造成傷害。為此，錢永健發明了一種有機染料，這種染料分子無需注射即可穿透細胞壁。1981年獲得加州大學伯克利分校的教職後，錢永健又對自己發明的鈣染料進行了改進，使其使用更方便，適用性更廣。

1989年轉到聖迭戈分校後，錢永健的關注點由細胞內的鈣離子轉向細胞內的環腺苷酸(cAMP)。環腺苷酸被稱作為細胞內的第二信使，它通過激活蛋白激酶來實現對細胞功能的調節。根據這一性質，錢永健團隊開發了一種熒光染料。將蛋白激酶染上這種熒光染料後，再將其注入細胞內，這樣人們便可以通過觀察蛋白激酶被激活的程度來了解環腺苷酸的活動情況。顯然，使用這種方法甚為不便。因此，錢永健1992年4、5月之間看到普拉舍和瓦德等人在《基因》雜誌上發表的那篇文章後，頓覺眼前一亮，他彷彿看到了用多管水母GFP取代化學熒光染料開展熒游標記研究的曙光。

錢永健聯繫上普拉舍後，得到了可以免費獲取多管水母GFP基因的答覆。與長期從事線蟲觸覺神經研究的查爾菲不同，主要從事化學熒光染料開發的錢永健並不擅長基因重組操作，而且其團隊中當時並無這方面的專才，因此並沒有馬上開展GFP表達研究，以致率先實現多管水母GFP基因在異源生物細胞中的表達之功被查爾菲團隊捷足先登。

1992年9月，一位受過分子遺傳學訓練、名叫海姆（Roger Heim）的瑞士籍博士後研究人員加盟錢永健實驗室。以此為契機，錢永健啟動了對GFP的研究。其團隊在研究過程中發現，多管水母GFP在有氧情況下才會發光，於是他們推斷，氧分子是其發光的唯一輔助物。由於氧氣無處不在，故他們進一步推斷多管水母GFP基因可以在任何有機生物的細胞中獲得表達。

因野生型多管水母GFP有兩個激發峰，光穩定性不好，而且熒光強度弱，需要紫外線照射的時間長，錢永健決定優先從解決野生型多管水母GFP的諸多不足處入手，以促進GFP標記技術的應用與普及。這樣，對多管水母GFP結構進行解析與改造自然而然地就成了錢永健團隊的研究重點。當錢永健團隊正在為如何下手才能快速有效地改良多管水母GFP發光性質而苦惱時，傳來了凱利·穆利斯(Kary Mullis 1944-)因發明PCR技術、邁克爾·史密斯(Michael Smith 1932-2000)因發明對DNA特定位置實行定點突變的方法而獲1993年諾貝爾化學獎的消息。穆利斯雖然在1984年就完成了PCR技術的發明，但這項技術直到其同事於1988年從溫泉中分離中一株嗜熱桿菌之後才獲得推廣應用。PCR技術的推廣應用又為史密斯1978年初次提出、1985年進一步完善的基因定點突變方法的普及奠定了基礎。不難看出，1993年諾貝爾化學獎實際上獎勵的是剛剛興起的兩項分子生物學技術。受這兩項新興技術的影響，錢永健團隊決定採用隨機誘變的方式來改組GFP基因，進而篩選出激發峰和熒光強度等都得到優化的GFP衍生物。

?熒光細菌菌落。來源：聖迭戈大學錢永健實驗室

錢永健團隊先後製作了6000種、突變點不盡相同的多管水母GFP基因模型，並從其表達物中發現了若干激發峰由紫外區移至藍光區、綠色熒光強度明顯增大的多管水母GFP變種，以及一種發藍色熒光和一種發青色熒光的多管水母GFP突變體。進一步的研究表明，藍色熒光蛋白是因多管水母GFP中的第66位氨基酸——酪氨酸被轉換成組氨酸造成的；如果第66位的酪氨酸被色氨酸取代後則發青色的熒光。1994年12月，錢永健團隊公開發表了這些研究成果。翌年2月，該團隊又在英國的《自然》雜誌上發文重點介紹了一種單點突變後形成的增強型GFP——S65T。這種熒光蛋白與野生型多管水母GFP相比，光穩定性和熒光強度獲得了大幅度的改善，激發峰的波長也提高到了更方便使用的488納米。

多管水母GFP的發光性質是由其結構決定的。儘管普拉舍等人已經測出了組成多管水母GFP的238個氨基酸的排序，並且闡明了其發光基團的一級化學結構，但是人們對多管水母GFP的晶體結構，也即三維結構仍知之不詳。這顯然不利於使用定點突變的方法改進GFP的發光性能。為此，錢永健和俄勒岡州立大學的詹姆斯·雷明頓(S. James Remington)等人合作使用X射線晶體衍射分析法於1996年解析出了多管水母GFP的S65T突變體的晶體結構。同年萊斯大學的喬治·飛利浦(George Phillips)團隊也使用相同方法獨立地解析出了野生型多管水母GFP的晶體結構。結果表明，多管水母GFP是一個由11條β-摺疊繞成的圓筒狀結構，一條α螺旋的肽鏈沿圓筒中軸線分布。由第65至67位的三個氨基酸（絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸）組成的發光基團嵌在α螺旋上，幾乎被包埋在圓筒的中心。

弄清多管水母GFP的三維結構後，人們便不難理解為何將第66位的氨基酸——酪氨酸轉換成組氨酸或色氨酸後，所獲得的突變體便會發出藍色或青色的熒光，因為GFP發光基團的分子結構已經被改變了。那麼使用定點突變的方法改變多管水母GFP發光基團周圍的氨基酸結構是否能製造出科研所需的新的GFP衍生物？順著這條思路，錢永健團隊利用與雷明頓合作所取得的有關多管水母GFP晶體結構數據，通過使用計算機輔助設計，最終獲得了一種新的GFP衍生物——黃色熒光蛋白。黃色熒光蛋白是錢永健團隊採用定點突變方法將位於多管水母GFP發光基團正下方的第203位氨基酸——蘇氨酸換成酪氨酸製成的。

藍色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，不僅為同時追蹤多種蛋白質分子在細胞內的活動情況提供了方便，而且還為依據熒光共振能量轉移理論研究不同蛋白質之間的相互作用提供了一個有效的工具。但是，在查爾菲用多管水母GFP作示蹤分子取得成功後的最初幾年裡，無論錢永健等人如何努力，都無法基於多管水母GFP分子結構改造出應用範圍更廣的紅色熒光蛋白。在各種可見熒光中，紅光的穿透性最強，如果有了紅色熒光蛋白，人們便可以更方便地觀察非透明動物的細胞，乃至細胞內的蛋白質活動情況。而紅色熒光蛋白的發現乃錢永健團隊1996年「設計」出黃色熒光蛋白三年後之事。

?多種顏色熒光的大腸桿菌組成的「錢氏實驗室」字樣。。來源：聖迭戈大學錢永健實驗室

1999年，俄羅斯科學院舍米亞金和奧夫欽尼科夫(Shemyakin-Ovchinnikov)生物有機化學研究所(前身為天然化學產物研究所)謝爾蓋·盧科亞諾夫(Sergey Lukyanov,1963-)團隊從珊瑚蟲中發現了六種特性與多管水母GFP相似的蛋白質，即GFP類似物(GFP-like proteins,縮寫為GFPs)。其中的四種發綠色熒光，一種發黃色熒光，一種發紅色熒光。在此之前，沒有一個人嘗試著從珊瑚蟲中去尋找多管水母GFP類似物，因為珊瑚蟲並非發光生物。紅色熒光蛋白的發現標誌著熒光蛋白標記技術的發展又躍上了一個新台階。

錢永健團隊在全力開發多管水母GFP突變體之時，另外一些團隊則在設法找尋多管水母GFP類似物。如前所述，早在七十年代，瓦德和考彌爾就從發光海腎中提取到了多管水母GFP類似物。之後，人們又從其它發光生物中提取到了數種多管水母GFP類似物。這些GFP類似物與多管水母GFP一樣，擔負著第二級發射器的使命，也即負責接收體內發光蛋白質生產出的頻率較高的光能然後把它轉換成頻率較低、波長更長的光能並將其發射出去。由於現有的GFP類似物和多管水母GFP一樣都是從發光生物中提取出來的，而且其發光機理與多管水母GFP也很相似，所以那些試圖尋找新型GFP類似物的團隊大多以發光生物為研究重點。儘管他們的篩選研究並非毫無收穫，但是歷經千辛萬苦尋獲的幾種GFP類似物都沒有太大的應用價值。篩選研究之所以收效甚微，主要是因為這些團隊被多管水母GFP及其類似物都是從發光生物中提取出來的表象迷惑住了。此外，由於像多管水母這樣的發光生物是無色透明的，所以都以為多管水母GFP及其類似物的存在與生物本身的顏色無關，關鍵是生物要能夠發光。

和其他團隊一樣，盧科亞諾夫團隊一開始也打算從發光生物入手，以期能夠從中篩選出具有較高應用價值的新型GFP類似物，尤其是紅色熒光蛋白。盧科亞諾夫1985年畢業於莫斯科大學胚胎學系，1994年在俄羅斯科學院生物有機化學研究所獲博士學位後，留在該所再生基因實驗室擔任資深科學家主要從事選擇性抑制PCR技術的改良研究和蠑螈、渦蟲再生基因的克隆與測序研究。後者主要是在該所博士生米哈伊爾·馬茲(Mikhail Matz)的協助下展開的。由於GFP類似物的篩選研究與其先前從事的研究相近，故盧科亞諾夫決定抓住機遇及時啟動自身擁有一定競爭優勢的GFP類似物篩選研究。

但是，盧科亞諾夫和馬茲的GFP類似物篩選研究計劃遭到了俄羅斯科學院生態與進化研究所主要從事生物發光系統進化研究的專家優里·拉巴斯(Yulii A. Labas,1933-2008)的質疑。拉巴斯向前來聽取意見的盧科亞諾夫和馬茲指出：被他們列作篩選對象的發光生物大都和多管水母沒有近緣關係，且大都出現得比較晚。雖然發光生物體內都含有發光蛋白質，但是多數發光生物體內未必有GFP類似物。GFP類似物是熒光蛋白，它和光能的生產無關。因此，不發光的生物體內未必沒有GFP類似物。一些珊瑚蟲自身並不發光，但卻能發出綠色的熒光。為什麼不發揮想像力，試一試這類自身並不發光的熒光生物？拉巴斯的建議對盧科亞諾夫和馬茲的觸動很大。之後，二人便開始將那些顏色鮮明、並能發出熒光的珊瑚類物種確定為優先篩選對象。

篩選研究過程中，若採用下村修當年所使用的方法，即先將熒光蛋白設法從生物體中分離出來，然後再進行純化、分析，那麼篩選研究將會非常耗時，而且好不容易提取出來的蛋白質未必就是想要的GFP類似物。因此，盧科亞諾夫團隊只能另闢蹊徑。在生物化學領域積累了豐富研究經驗的盧科亞諾夫經過一番分析後意識到，如果珊瑚中確實有GFP類似物，那麼它的大小應該和多管水母GFP差不多，而且一些重要部位的結構，譬如發光基團和β-摺疊拐點處的氨基酸排序應該和多管水母GFP相同。這意味著可以嘗試著採用普拉舍當年分離、複製多管水母GFP基因時所使用的技術來解決從珊瑚中提取GFP類似物之難題。研究技術路線確定之後，接下來就是付諸行動了。

當時俄羅斯尚未從蘇聯解體後的混亂中恢復過來，和西方同行相比科研經費談不上充裕的盧科亞諾夫團隊，一開始用來研究的第一批熒光珊瑚是從莫斯科市內的水族館商店中廉價買來的。幾個月後，他們從一種被稱作為海葵的熒光珊瑚中找到了GFP基因，並成功地對該基因進行了克隆。這項成就的取得證明拉巴斯的推測是正確的，盧科亞諾夫確定的研究技術路線是可行的。此後，盧科亞諾夫團隊的士氣大增，他們遠赴印度洋、西太平洋採集了多種色澤鮮明的珊瑚蟲。在莫斯科的實驗室里將這些珊瑚蟲中與顏色有關的DNA分離出來，並進行擴增之後，他們找出了重要部位的氨基酸排序與多管水母GFP相同的六種蛋白質。進一步研究表明，這六種蛋白質的熒光性質與多管水母GFP有著驚人的相似之處，且能在青蛙和哺乳類動物細胞中獲得高效表達。其中，一種發紅色熒光，一種發黃色熒光，剩下的四種則發綠色熒光。1999年10月，《自然—生物技術》刊發了這一研究成果。

2000年，已擔任生物有機化學研究所分子技術實驗室(前身為再生基因實驗室)主任的盧科亞諾夫率領團隊使用錯配PCR技術篩選發光速度更快、亮度更高的紅色熒光蛋白突變體時意外地發現，有一種突變體，它一開始發出的熒光呈綠色，之後在24小時內逐漸轉變為黃色、橘黃色和紅色。利用這一特性，他們開發出了一種熒光鍾，藉以了解基因啟動子的活性隨時間的變化情況。而且，有人據此推測GFP是紅色熒光蛋白受損後固化下來的產物。後來人們發現，紅色熒光蛋白中的第83位氨基酸被替換掉之後，它就只能發綠色熒光。這項研究為上述推測提供了一個再好不過的註腳。此外，2000年，盧科亞諾夫團隊還從非熒光生物溝迎風海葵(Anemonia sulcata)中提取到了紫色的GFP類似物。這樣，與彩虹兩側同色的GFP類似物都被盧科亞諾夫團隊找到了。

由於波長較長的紅色熒光蛋白的應用前景非常廣，所以它引起了人們的高度關注。2000年10月，馬茲就和雷明頓團隊合作完全解析清楚了它的晶體結構。與此同時，美國的另一個團隊也獨立地解明了紅色熒光蛋白的晶體結構，而且還搶先一個月發表了。雖然紅色熒光蛋白的晶體結構與多管水母GFP的晶體結構極其相似，但它通常都以四聚體形態出現。這樣，用其標記目的蛋白質時，很容易引起目的蛋白質性質的變化。2002年，錢永健團隊成功地開發出了單體形態的紅色熒光蛋白突變體。此後，紅色熒光蛋白就和多管水母GFP一樣，可以很方便地用於標記研究了。由於紅色熒光蛋白基因是從生活在熱帶海洋中的珊瑚蟲里提取的，所以它在室溫下的表達速度比從生活在北太平洋的多管水母中提取的多管水母GFP基因更快。

?正在瀏覽諾獎網站的錢永健，他半夜接到來自斯德哥爾摩的電話，得知自己獲得諾獎。來源：聖迭戈大學

綠色熒光蛋白的發現、表達與開發：諾貝爾獎究竟給誰？

通過上述考察，我們可以得出如下結論：

1. 1962年，在普林斯頓大學做博士後研究的下村修在開展多管水母發光物質研究時首次發現「綠色蛋白質」。

2. 1969年，哈佛大學的伍迪·哈斯廷和詹姆斯·莫林在研究腔腸動物發光蛋白質特性時再次「發現」了多管水母「綠色蛋白質」，並將其命名為「Green Fluorescent Protein」，即綠色熒光蛋白。

3. 1979年，下村修在研究多管水母綠色熒光蛋白分子的發光機理過程中，受海螢研究的啟發推測出了多管水母綠色熒光蛋白分子發光基團的化學結構。

4．1991年，道格拉斯·普拉舍在美國伍茲霍爾海洋生物學實驗室工作期間，用實驗驗證了下村修推測出的結構。同年，他還成功地分離出了多管水母綠色熒光蛋白基因，並使用細菌的質粒作載體對其進行了複製，確定了多管水母綠色熒光蛋白的基因序列。

5.1993年，在美國哥倫比亞大學執教的馬丁·查爾菲使用普拉舍提供的含有多管水母綠色熒光蛋白基因的質粒，做綠色熒光蛋白基因表達實驗時取得成功，先後從大腸桿菌的體內和線蟲的神經細胞內觀察到了多管水母綠色熒光蛋白髮出的熒光，實現了綠色熒光蛋白在異體內的表達。

6. 1994年，加州大學聖迭戈分校的錢永健基於普拉舍等人的研究採用剛剛興起的隨機誘變方法改組綠色熒光蛋白基因時，獲得了一種光穩定性和熒光強度都好於野生型的多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體，以及一種發藍色熒光和一種發青色熒光的多管水母綠色熒光蛋白突變體。

7. 1996年,錢永健和俄勒岡州立大學的詹姆斯·雷明頓等人合作解析出了多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體的晶體結構。同年,萊斯大學的喬治·飛利浦團隊也完整地解析出了野生型多管水母綠色熒光蛋白的晶體結構。

8．1996年，錢永健團隊利用與雷明頓合作所取得的有關綠色熒光蛋白晶體結構數據，通過使用計算機輔助設計，成功地開發出了一種新的綠色熒光蛋白衍生物——黃色熒光蛋白。綠色、藍色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，為同時追蹤多種蛋白質分子在細胞內的活動情況提供了方便。

9．1999年，俄羅斯的盧科亞諾夫團隊在篩選具有較高應用價值的新型綠色熒光蛋白類似物，尤其是紅色熒光蛋白過程中，從珊瑚蟲中發現了四種發綠色熒光、一種發黃色熒光和一種發紅色熒光的綠色熒光蛋白類似物。第二年，該團隊又從非熒光生物溝迎風海葵中提取到了紫色的綠色熒光蛋白類似物。

10. 2002年，錢永健團隊成功地開發出了單體形態的紅色熒光蛋白突變體,解決了紅色熒光蛋白通常以四聚體形態出現，用其標記目的蛋白質時容易引起蛋白質性質變化的難題。更適合作為標識的紅色熒光蛋白的問世標誌著熒光蛋白標記法的應用與普及步入了一個新時代。

自下村修1962年發現多管水母綠色熒光蛋白到查爾菲1993年實現多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達整整經歷了31年。在這31年里，儘管下村修推測出了多管水母綠色熒光蛋白分子發光基團的化學結構，普拉舍成功地對多管水母綠色熒光蛋白基因進行了分離與複製，並確定了其基因序列，從而深化了人們對多管水母綠色熒光蛋白結構與性質的認識，使人們無須大量捕撈野生多管水母就可以批量製備多管水母綠色熒光蛋白，但是，在此期間，人們始終未能為多管水母綠色熒光蛋白找到應用之途，科學發現始終未能轉化為技術發明。

多管水母綠色熒光蛋白的研究由基礎研究階段邁入應用研究階段的標誌是查爾菲成功地實現了多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達。查爾菲1993年進行活細胞示蹤實驗時，能夠從大腸桿菌的體內和線蟲的神經細胞內觀察到多管水母綠色熒光蛋白髮出的熒光，無疑與下村修、普拉舍等人開展的基礎研究有關。沒有眾多科學家們的前期研究積累，便不會有查爾菲的重大研究突破。查爾菲實現多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達既是一項科學發現，也是一項技術發明。說其是科學發現，是因為查爾菲用實驗證明多管水母綠色熒光蛋白無需任何輔助因子和反應底物，就可以自行形成發光基團。說其是技術發明，是因為查爾菲用實驗證明可以使用多管水母綠色熒光蛋白來進行生物分子示蹤。這種新方法的發明，為生物學的大發展提供了一種全新的工具，開啟了使用生物熒光材料進行生物分子示蹤研究的先河。

儘管查爾菲首創了使用多管水母綠色熒光蛋白進行生物分子示蹤研究的新方法，但多管水母綠色熒光蛋白並非是理想的生物熒游標記材料，而且只有綠色熒光蛋白時，人們無法同時進行多細胞跟蹤研究。這樣一來，如何進一步改進綠色熒光蛋白示蹤效果，研製更多顏色的熒光蛋白，就成了擺在科學家面前的一項重要課題。針對這一需求，錢永健團隊自1994年起使用剛剛興起的隨機誘變方法開發出了多種不同顏色的多管水母綠色熒光蛋白突變體。但是，這些突變體的熒光激發波長都小於綠色熒光蛋白。因此，在多管水母綠色熒光蛋白的晶體結構被完全解明之後，錢永健1996年又通過改造多管水母綠色熒光蛋白的分子結構，「設計」出了一種熒光激發波長更長的黃色熒光蛋白。錢永健在1994-1996年的三年里所開展的綠色熒光蛋白改良研究，可以說是在應用方向已經相當明確的情況下開展的一種旨在滿足分子生物學發展需求的技術開發活動。

由於在可見光中，紅色熒光蛋白的熒光激發波長最長，所以更適合作示蹤材料。問題是如何開發出這種能夠更好滿足生物研究需求的紅色熒光蛋白。經過不斷探索，俄羅斯科學家盧科亞諾夫最終獨闢蹊徑，於1999年從非發光生物——珊瑚蟲中分離出了紅色熒光蛋白基因。但是，使用從珊瑚中分離出的紅色熒光蛋白基因製備的紅色熒光蛋白通常都以四聚體形態出現，仍然不適合作生物熒游標記材料。因此，研製單體形態的紅色熒光蛋白成了當務之急。最終成功解決這一難題的仍然是錢永健，時間是2002年。此後，科學家們便可以很方便地將不同的蛋白質或細胞「染上」不同的顏色，藉以跟蹤研究其活動過程。

要而言之，儘管很多科學家都參與了多管水母綠色熒光蛋白的研究開發競爭，而且很多參與者都做出了原創性的貢獻，但是做出了具有里程碑意義的開創性貢獻的只有兩人，一是下村修，二是查爾菲。不過，如果沒有錢永健的研究貢獻，使用生物熒游標記材料進行蛋白質或細胞示蹤研究便不可能快速地獲得廣泛普及，分子生物學也就不可能獲得像今日這樣的突飛猛進的發展。因此，瑞典皇家科學院決定將2008年的諾貝爾化學獎授予對多管水母綠色熒光蛋白的發現、表達和開發做出了傑出貢獻的三位科學家：下村修、馬丁·查爾菲和錢永健乃理所應當。

?2008年12月6日，下村修（左）、查爾菲（中）、錢永健（右）三人在斯德哥爾摩接受http://Nobelprize.org採訪。來源：Nobel Media AB 2008

本文獲作者授權刊發。參考文獻參見周程：「諾貝爾獎級科學成就究竟是怎樣取得的？——綠色熒光蛋白的發現、表達與開發」，《安徽大學學報（哲學社會科學版）》2016年第4期。

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