中科院神經所在世界上首次獲得基因敲入的食蟹猴的研究有何突破？基因敲入相比於基因敲除有哪些難點？

中科院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心、神經科學國家重點實驗室楊輝研究組與蘇州非人靈長類研究平台孫強團隊合作，利用了一種以同源臂介導的末端接合（HMEJ）為基礎的基因敲入策略，在世界上首次獲得了基因敲入的食蟹猴。1月12日，這一重要研究成果以題為《運用CRISPR/Cas9編輯技術獲得基因敲入食蟹猴》在線發表於《細胞研究》期刊。

由於基因修飾猴模型可以用於模擬人類疾病癥狀，因此它可以作為研究人類疾病機制和推進臨床治療的工具。然而, 由於普通猴具有繁殖周期長(5-6年一代)，幼仔數量少（每胎一隻）以及基因編輯效率低等特點，導致構建靶向基因編輯猴具有很大的困難和挑戰性。最近的一些研究表明，CRISPR/Cas9系統可以用於構建基因敲除猴。然而，與基因敲除相反，由於種種原因例如效率低，到目前為止仍然還沒有基因成功敲入猴的報道。

對基因修飾猴模型而言，基因敲入與基因敲除相比，技術的不同、難點在哪裡？此次基因敲入猴的獲得有哪些意義？（食蟹猴一般用於哪些神經科學研究？有何優點？）

原文鏈接：

Generation of knock-in cynomolgus monkey via CRISPR/Cas9 editingwww.nature.com

噗，這道題應該會很冷清吧。挽一下芝士喵的尊。

簡單來講，要在食蟹猴上做基因編輯，首先得有個全基因組圖譜吧。這項工作是我博導投資聯合華大基因搞出來的，當年Nature Biotechnology的封面文章。（所以不要整天說華大基因測序灌水沒意義，這他喵的就是意義

然後是，在knock in donor上加個sgRNA切割序列提高插入編輯效率這一點呢，早就有人這麼幹了，不是什麼新鮮事。

最後是knock in為何效率比knock out低，那是因為in是在out的基礎上還有個利用donor進行DNA修復的過程嘛。兩個較小概率一乘，當然越乘越小咯。

文章亮點在於，猴子一隻一萬挺貴的，培育周期又很長，沒有錢沒有覺悟的實驗室做不來。

首先要知道，基於CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1的基因敲除原理是什麼。

CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統只具有雙鏈DNA切割功能。

經過基因改造的II型CRISPR/Cas體系可用於在預先設定靶向的目標序列處切割基因組DNA。

CRISPR/Cas9系統中，由crRNA和tracerRNA（改造後連接二者稱sgRNA）結合帶有核定位信號的Cas9，並引導其靶向核內gRNA和PAM （動物中NGG，植物中NGG或NAG）對應的區域，通過Cas9的切割結構域造成PAM附近（通常是PAM上游第三個鹼基處）的DNA雙鏈斷裂（DSB）,斷裂為平末端。

CRISPR/Cpf1系統中，由crRNA結合帶有核定位信號的Cpf1，並引導其靶向核內gRNA和PAM （TTN）對應的區域，通過Cpf1的切割結構域造成PAM附近（通常是PAM下游約18鹼基處）的DNA雙鏈斷裂（DSB），斷裂為黏末端。

CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系統只具有雙鏈DNA切割功能，那麼為何可以產生基因敲除的效果呢? 還要藉助於DNA的修復。

DNA斷裂是極其危險的事件，細胞會有不同的方式來應對DNA的損傷，並通過多種方式進行DNA損傷修復。對於DSB而言，主要有以下兩種修復途徑：非同源重組修復與同源重組修復。

對於基因敲除而言，依賴的不僅僅是CRISPR系統造成DSB，還有而後細胞通過非同源重組方式造成的修復錯誤。有了錯誤才會有突變，如鹼基插入或缺失，鹼基替換。插入或缺失通常造成移碼及提前終止，這樣靶基因就無法產生正常mRNA及相應蛋白，這就是我們要的敲除。

簡言之，修復出錯才有可能出現敲除，有一部分DSB被修好了，就不會有敲除的結果，敲除通常依賴於非同源重組修復過程中的修復錯誤。

那麼，敲入是如何實現的？

敲入依賴於產生DSB的基因組DNA與供體片段之間的同源重組修復，將各種標籤或基因敲入基因組的特定位置。由於基因組DNA與供體片段之間的同源重組效率特別低（低於2%），這就要提供大量的帶同源臂的DNA片段作為供體。特別是針對植物細胞，利用農桿菌介導的遺傳轉化過程中，將供體片段和sgRNA、Cas9編碼序列通過T-DNA轉入植物細胞中，T-DNA一旦整合到染色體，供體片段就不能以遊離的形式作為同源重組的敲入供體，效率就更低了。中科院上海植物逆境生物學研究中心利用雙生病毒提供大量供體，也因此大大提高了敲入效率。

基因敲除具有重要意義。

比如通過敲除、回補等試驗研究基因功能，比如敲除代謝途徑中關鍵基因進而使代謝朝著人類希望的目標產物方向移動，再比如敲掉水稻Cd鎘的主要轉運蛋白OsNramp5（擬南芥中的對應同源基因是AtNramp1），可以創製低鎘水稻。

但是基因敲入呢？我們有轉基因手段為何還要敲入？

首先，轉入的內源基因與外源基因的表達總是有差異的。比如驗證基因功能時做回補，將該基因轉入突變體後表型恢復，則可認為該表型是由這一基因缺失以後產生的，但是，這隻能定性不能定量，當你想研究基因或蛋白水平時，即使轉基因使用native的promoter，也會由於插入位置效應，鄰近基因影響以及染色質結構等諸多因素造成轉入基因的表達水平與內源基因不同。這時候往往希望對目標基因進行原位編輯。

對於引入HA-tag、Flag-tag，在基因編碼序列後加上 LUC，GUS，GFP 等，原位敲入總是比外源轉入得到的數據更具有說服力。

因此，敲入和敲除一樣，具有極其著重要的意義。由於敲入需要藉助同源重組修復效率較低，真核生物基因敲入的諸多成功案例也標誌著我國動植物基因編輯的發展與進步。

要有工匠精神。

用CRISPR/Cas9進行基因敲入，相當於人為製造DNA斷裂，再導入目的基因序列，以期在細胞進行DNA修復時通過同源重組插入目的基因；

而基因敲除只需要製造DNA斷裂就行，不提供目的基因模版，所以相當於少了一個步驟，成功率當然比較高。

這個實驗主要難在猴子。在果蠅里這種實驗基本上隨便一個遺傳/細胞實驗室就能做出來；在小鼠裡面就已經比較貴了，一套下來要幾萬到十幾萬人民幣；在猴子里，我不知道這項目具體花了多少，不過肯定遠貴於老鼠。

總的來說證明這項技術在靈長類動物中也是適用的，摸出一些具體的實驗步驟，沒有什麼概念性的突破。

另外最近還有一個新聞：

http://mp.weixin.qq.com/s/kaoYK2opy1T_ZqZBy-d_EQ

CRISPR/Cas9在成體裡面似乎因為免疫反應而用不了。也就是說沒有基因治療這一說，也就只能像這篇文章一樣操作一下受精卵。不過可以結合一下治療性克隆的技術，克隆出基因改造過的器官，然後移植。