技術剖析：分子診斷之爭：LAMP VS. PCR

基於核酸擴增的分子診斷是通過引物介導特異性擴增目的基因以檢測內源性（遺傳或變異）或外源性（病原體）目的基因的存在與否，進而對疾病的診斷和治療提供信息和決策依據。其主要的應用場景有傳染病的診斷，血篩，腫瘤早期輔助診斷，腫瘤的分子分型，遺傳病的診斷，產前診斷，組織分型等。其中在傳染病的診斷和血篩方面，基於核酸擴增的分子診斷能縮短診斷的「窗口期」，並且可以定量對病原體進行檢測。相比於傳統的免疫診斷方式而言，有不可替代的優勢。

一方面，由於PCR技術的不斷成熟，特別是實時熒光定量PCR (qPCR)的出現，使得基於qPCR的分子診斷產品日漸成為主流。這一塊有幾個明星產品：賽沛（Cepheid）的GeneXpert PCR分析儀，BioFire的filmArray，IQuum的cobas Liat PCR System 以及Atlas Genetics的io。這幾個明星產品的孵化公司都無一例外地被全部或部分收購。這裡的賽沛在2016年9月被丹納赫以40億美元收購；BioFire在2013年9月被生物梅里埃宣布以4.5億美元收購；IQuum 在2014年4月被羅氏以4.5億美元收購；英國Atlas Genetics在2016年的年底也被萬孚生物以約1.25億人民幣收購了14.95%的股權。競爭激烈和受歡迎程度由此可見一斑。這幾款產品也都是基於微流控的分子診斷產品。另外，我國的博暉創新也於2017年發布了一款基於PCR微流控全自動核酸檢測系統。

圖1. BioFire的filmArray

另一方面，環介導等溫擴增技術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）是Notomi等在1998年報道的一種等溫核酸擴增技術。該法依賴於識別保守序列DNA的6個特異性片段的4條引物（2條外引物和2條內引物）和一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）。LAMP檢測體系中基因的擴增和產物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在30～60min擴增10^9～10^10倍，特異性較高。LAMP技術的主要原理是DNA在65℃左右可以處於動態平衡狀態，DNA在此溫度下利用4條特異性引物依靠一種鏈置換DNA聚合酶，使鏈置換DNA的合成不停地自我循環。基於這一技術的典型產品是我國的博奧生物的晶芯RTisochipTM-A恆溫擴增微流控晶元核酸分析儀以及百康芯的iChip-400。

圖2. 博奧生物的晶芯RTisochipTM-A恆溫擴增微流控晶元核酸分析儀

本文將重點比較分子診斷中競爭較為激烈的LAMP和實時熒光定量PCR(qPCR)兩種技術的優劣。

1. 儀器成本

LAMP只要一個溫度（65度左右），相對於qPCR的三個溫度的循環，基於LAMP的擴增儀器的溫控更容易實現。所以基於LAMP的儀器更簡單更便宜，加熱耗能更少。

但是另一方面來看，LAMP的引物設計難度高，試劑成本也相應高於qPCR。

圖3. qPCR技術需要三個溫度的循環

2. 擴增速度

同樣由於LAMP只要一個溫度（65度左右），相對於qPCR的三個溫度的循環，LAMP擴增不需要反覆的升溫降溫過程，所以基於LAMP的擴增速度快於qPCR的擴增速度。LAMP一般可在30～60min擴增10^9～10^10倍，而qPCR的擴增速度往往取決於擴增儀器加熱和冷卻的速率。

由於LAMP可以短時間內獲得大量的DNA產物，所以可以實現基於濁度的可視化檢測。從這個角度上講，LAMP尤其適用於定性的POCT。

3. 擴增特異性

由於LAMP技術一般需要相對較長6個引物，而qPCR只用2個引物，在核酸擴增中只有所有的引物序列都匹配才擴增，所以基於LAMP的核算擴增特異性更強。也就是說，同樣條件下LAMP的誤擴增的概率更低。

圖4. LAMP擴增一般需要6個引物

這一方面，筆者並沒有找到有效的數據證據。因為擴增的特異性與引物的設計息息相關，所以並不能簡單的比較兩個技術的擴增的特異性。基於兩對引物的巢氏PCR的出現也大大的增強了qPCR特異性，這裡最典型的應用實例就是filmArray。

圖5. 使用兩對引物的巢氏PCR技術進一步提高了擴增的特異性

4. 檢測的靈敏度

案例1:

Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-time PCR）分子診斷技術對於弓形蟲DNA的檢測極限分別是10fg/ul和1fg/ul。常規PCR，LAMP，qPCR檢測284隻豬和292羊對應檢測出的弓形蟲陽性比例為：0.4%，3.2%，4.2%和 3.8%，17.1%，17.8% [1]。

案例2:

Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口瘡病毒檢測中，LAMP正確識別出46隻陽性中的41隻（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正確識別出了46隻陽性中的42隻(91.30%) [2]。

案例3：

Yi Tang等人的研究表明在坦布蘇病毒的檢測中，qPCR和LAMP的DNA檢測極限分別為：2copies/ul和20copies/ul；RNA檢測極限分別為10fg/tube和100fg/tube。檢測出來的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7% [3]。

案例4：

Chapey E.等人的研究表明，在臨床弓形蟲檢測中，有一個病例qPCR檢測出來了，LAMP沒有檢測出來；LAMP檢測出來的qPCR均能檢測出來；LAMP還有兩個病例不確定，qPCR並沒有 [4]。

圖6. LAMP和qPCR在臨床弓形蟲檢測中的結果對比

總結：以上四組案例均表明，qPCR的檢測靈敏度高於LAMP。也就意味著，同樣的條件下，qPCR檢測的假陰性概率低於LAMP。

5. 對抑製劑的敏感性

LAMP對樣品中抑製劑敏感性低於qPCR，這也就意味著LAMP對擴增環境的要求低於qPCR。

6. 通量

眾多周知，在實際的產業化中，分子診斷儀器的通量往往至關重要。對於qPCR而言，由於引物設計的成熟和熒光通道的多樣性，往往可以比較好的實現高通量檢測。我們所熟知的基於多重PCR的filmArray最高一次可以並行檢測二十幾個指標。

另一方面，由於LAMP的引物需要4-6個（qPCR兩個）且LAMP引物一般較長，LAMP的引物設計難於qPCR（雖然有LAMP引物檢索網站的協助，但這個問題依然存在）。引物設計困難也導致了LAMP的檢測通量受限。

結語：LAMP雖然很好的解決了PCR的溫控難題，但是也相應帶來了其他的問題，比如相對於qPCR而言，檢測靈敏度不夠，引物設計更困難等。這裡面最大的問題還是相對於PCR很成熟的技術體系而言，LAMP目前還需要不斷的優化和發展。我們也期待著LAMP技術的成長，從而為分子診斷帶來更好的產品。

參考文獻：

1. Lin Z, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat element for diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2): 296-300.

2. Wang G, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermal amplification for orf virus withquantitative real-time PCR[J]. Virology journal, 2013, 10(1): 138.

3. Tang Y, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detection of Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.

4. Chapey E. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.

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