【連載】漫談PHA（2）從細菌到細胞——PHA的醫學組織工程探索

本文首發於微信公眾號藍晶實驗室

作者：北華揚天

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首先需要說明的一點是，PHA本來存在於微生物體內，所以不能直接用於醫學組織工程，而是需通過提取過濾和純化，除去細菌碎片、有毒溶解物和熱原成分（如內毒素），最後得到的，才是醫用級的PHA材料。這些PHA，可加工成膜、纖維、管、三維支架、微球等不同的PHA形態（圖1）。

PHA從在細菌中生產，到可以用於細胞生長，簡直是華麗的轉變——完美！！！

圖1. 醫用級的PHA材料（上圖）、PHA膜（下左圖）、三維支架（下中圖）及纖維（下右圖）的微觀結構

是不是很高大上啊！！！！

這些醫用級PHA材料，可應用於骨組織工程、人工心臟瓣膜、血管組織工程、軟管組織工程、神經導管組織工程、肌肉組織工程、食管組織工程、皮膚組織工程等多種領域。接下來，讓我為大家逐項進行介紹。

骨組織工程

高機械性能是骨組織的顯著特徵，因而更適合採用較硬的PHA材料，如PHB和PHBV。

有人將PHB支架植入兔腿骨和小型豬的前顱底的缺損處，都發現PHB能夠促進新骨生成，這樣的人工支架與周圍組織生物相容性良好，長時間的體內修復過程中沒有出現嚴重的炎症反應。

除了PHB，PHBV在骨組織工程中也有很大的優勢：成骨細胞在PHBV支架上增殖和礦化水平更優；骨髓幹細胞在PHBV發泡材料上鹼性磷酸酶活性增加，骨鈣素等因子分泌增多，表現出更佳的成骨分化特徵，這在體內實驗中也得到了證實；與磷酸鈣膠原支架相比，PHBV支架的修復效果更好（損傷處癒合更快，且植入3周後出現的纖維組織更少）。

除了PHB和PHBV，其他的PHA材料也可用於骨組織工程的應用，效果也不錯，如PHBHHx。

人工心臟瓣膜

使用PHA製作人工心臟瓣膜已有成功的例子。

表面包被有P4HB的PGA無紡布製成的三尖瓣心臟瓣膜支架，依次接種上自體的肌成纖維細胞和內皮細胞，在體生長14d後，形成細胞支架複合三尖瓣心臟瓣膜（圖2），植入生長期的羊羔體內20周後，瓣膜大小由19 mm增加到23 mm，讓人們看到了人工製備「可生長」瓣膜的可能性。

同時，還有人嘗試過用PHB灌注和PHBHHx 包裹的方法改良脫細胞的豬動脈支架，結果顯示，PHA的加入可增大支架的彈性並降低支架表面細胞鈣化。

另外，一種新的PHA料，聚3-羥基己酸辛酸（即PHHxHO），被用於製作一個三尖瓣心臟瓣膜形狀的支架，該支架接種上自體的血管細胞後植入了羔羊肺部血管，雖然120天後發生了血管輕微狹窄，但未見血管栓塞。

血管組織工程

應用於血管組織工程的PHA主要有PHBHHx、 PHO（聚3-羥基辛酸）和P4HB（聚4-羥基丁酸）；其形態既有管狀的血管支架，也有可降解的大血管補片。

用PHO對PGA管狀支架進行表面包被，替換3-4cm長的羊羔腹主動脈，101天後，所有實驗動物均存活，且無動脈瘤形成，力學性能以及支架內總蛋白和總DNA含量逐漸接近正常動脈血管。

同樣,P4HB與血管細胞複合培養構建的血管補片（圖3）,被植入羊肺動脈近端169天後，能形成具有功能的血管組織，無血栓、再狹窄或者膨大現象，且P4HB支架幾乎被完全吸收。

相對於其他的PHA材料，PHBHHx的表面血小板黏附較少，溶血反應程度較低，也是一種良好的血液接觸材料。使用PHBHHx 材料包裹修飾的脫細胞血管支架，植入兔腹主動脈，12 周后發現複合血管補片表面細胞再生形成匯合細胞層，且與無PHBHHx 包裹修飾的支架相比，其細胞礦化程度更低。

軟骨組織工程

研究表明，PHB、PHBV和PHBHHx三種PHA材料都能支持軟骨細胞增殖並保持表型，且混合使用效果更佳。相比於單一PHB材料製成的支架，使用PHBHHx/PHB混合材料的支架，其上的軟骨細胞增殖更快、效果更好。這是因為，PHBHHx材料可促進軟骨細胞分泌更多的有助於細胞生長的Ⅱ型膠原和蛋白多糖胞外基質。

將用PHBV製成的多孔支架植入全層關節軟骨缺損處（直徑4.5mm，深度4mm），與使用磷酸鈣膠原（CaP-Gelfix）支架相比，PHBV組織工程軟骨可幫助損傷組織更快修復，支架表面形成了與正常關節軟骨類似的新生軟骨組織，並且其植入後的異物反應更少。

圖4. PHA支架在軟骨組織工程的應用

除了單純的PHA支架植入，也有人嘗試先將支架與軟骨細胞在體外複合培養，待形成人工關節軟骨後，再植入受損的兔膝關節的軟骨層（圖4）。16 周的修復過程中，支架沒有出現明顯的炎症反應，缺損區逐漸被新生軟骨組織所填充；由於預先植入了軟骨細胞，這些細胞分泌的軟骨基質使支架環境更加有利於與周圍組織融合，因而人工軟骨比空白支架實現了更加完整的表面癒合和更多的胞外基質積累。

除了關節透明軟骨修復，PHA支架還被用於纖維軟骨修復。

神經導管組織工程

有報道稱，PHB導管實現了大鼠坐骨神經缺損的修復，具有與自體神經移植類似的修復效果。為進一步改善PHB導管的生物活性，將外周神經的支持細胞（施旺細胞）接種到導管支架的內表面，再植入神經缺損處。後期觀察發現，帶有神經絲的神經元逐漸填充了PHB導管內部，並與支架上預先植入的細胞建立了聯繫。PHBHHx也表現出與神經細胞的良好相容性（圖5）。實驗證實，PHBHHx 神經導管支架同樣對長度為10mm的大鼠坐骨神經神經缺失有顯著的修復效果。

圖5. PHA導管在神經導管組織工程的應用

肌肉組織工程

PHB被證實具有一定的成肌誘導活性。研究人員將PHB支架置入到大鼠背闊肌肌袋中進行異位骨生成的實驗時，意外的發現，與支架接觸的肌肉組織細胞表達了更多的Ⅰ型肌球蛋白、胰島素樣生長因子IGF1 和血管內皮生長因子VEGF，而細胞中肌肉細胞抑制因子（GDF8）轉錄水平下降，這說明PHB支架具有一定的成肌誘導傾向。也有報道稱，將PHB材料用電紡絲的方法加工成定向納米纖維，會促使成肌細胞增殖減慢而開始向肌細胞分化。

食管組織工程

PHBHHx曾被加工成管狀支架，作為食管組織工程支架，植入實驗動物狗來替代其缺失的食管組織（圖6）。經過2個月的動物培養，實驗動物沒有出現任何明顯的排斥反應，體內的細胞能很好的遷移並貼附在人工食管上。儘管如此，實驗動物最終還是因無法進食而死亡。其原因是：PHBHHx支架的植入雖然有助了新生組織生成，但是該材料並沒有按預期降解、分裂及被吸收，從而妨礙了實驗動物的正常生理功能，最終，因食物在人工食管中阻塞而無法通過，導致了動物死亡。

皮膚組織工程

多種PHA材料（包括PHB、PHBV、PHBHHx、P4HB、P3HB4HB及PHBVHHx）都表現出與皮膚角質細胞HaCaT的良好的生物相容性。而且，上述PHA材料中，PHBVHHx 材料上的HaCaT細胞生長速率最快，與細胞培養板上的細胞增殖速率一致。另有研究者，使用PHB與PVA料混合製成納米級電紡絲纖維，作為基底來培養HaCaT細胞和真皮成纖維細胞，發現HaCaT細胞在PHB/PVA(1:1)混合材料上增殖最快，而成纖維細胞更偏愛純PHB材料。

四大特點

我們小結一下，PHA作為一種生物材料，在醫學組織工程的應用的一些特點。

1 需替換的組織特徵和PHA材料特性應一致

PHA材料多種多樣，有硬的脆的，如PHB和PHBV；也有軟的有韌，如PHBHHx、P4HB、PHO及其他中長鏈PHA。通常，骨組織工程等需要硬的PHA，所以PHB和PHBV是重要的研究對象；而血管、肌肉、心臟瓣膜等都是韌性強且柔軟的組織，所以P4HB等材料更理想。

2 PHA的生物相容性是普遍現象

不管應用於軟骨組織工程還是人造的神經導管，PHA都沒有導致強烈的組織排異反應，這主要是由於PHA的降解比較緩慢（比PLA慢），且降解產物主要為3-羥基丁酸（3HB），無毒無害。可見PHA的生物相容性是一個普遍現象。

3 PHA的醫學組織工程研究受到生產的制約

我們發現，在使用PHA的所有組織工程研究報道中，PHB、PHBV、PHBHHx三種材料被研究最多、應用最廣。主要是因為，它們是目前能大規模生產的三種材料，分別被行內人命名為第一代、第二代和第三代PHA。其他種類的PHA，在某些應用中，其性能可能更佳，但受限於低產量，未能得到充分的研究。

4 PHA在醫學組織工程領域的研究多但產品少

我們可以發現，雖然PHA是一種不錯的生物材料，是很多組織器官潛在的替換候選人，但目前卻並沒有什麼成熟的產品出現在我們身邊。這是為什麼呢？現在先賣個關子，等下一期一起介紹。

最後來兩句，真的只有兩句！

PHA是一個龐大的生物材料體系，我很難一兩期節目介紹完，所以先談應用再聊生產，謝謝大家的關注，也歡迎提問。Bluepha目前致力於PHA的生產和應用，當然也包含本期講的醫學組織工程應用，期待不久的將來我們能生產出PHA醫療產品，我們一直在努力。

下一期我們將聊聊PHA在藥學及醫療器械領域的應用，並回答本期挖的坑。

【參考文獻】

[1] 天然高分子基新材料——微生物聚羥基脂肪酸酯，陳國強，魏岱旭，化學工業出版社

[2]Chen G Q，Patel M. Chemical Rev，2012，112 ：2082-2099.

[3] 聚羥基脂肪酸酯支架材料製作中的掃描電鏡應用，林月娟，張泰星，李曉濤，中國組織工程研究與臨床康復. 2008.

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