我做的pcr跑完膠完全沒條帶怎麼回事？就好像沒加DNA似的。？

01-24

從基因組P還是從質粒P？marker是啥？目標片段多大？

上面有一條暗暗的窄帶，是模板還是產物？如果是（切開的）質粒或者固定長度的大模板好理解，如果是基因組模板未免也太窄了，看你把marker的條帶跑的這麼寫意不感覺那麼整齊的窄帶是基因組dna。 PS，看上去marker那條帶也有這個，是不是啥玩意兒污染了？

引物是固定的還是簡併的？根據保守序列、二聚體什麼的專門設計過么？是不是說確定可以p出來？模板有沒有測過序？把兩邊引物往外擴一段、改改反應參數試試？

模板dna質量很好么，沒有碎掉、沒有離子污染什麼的？引物質量沒問題？酶、緩衝液、水、etc都是好的？PCR儀是好的？放倆陽性對照看看啊

少年想解決問題要多給點信息啊……

從最底部的引物條帶看確實是加了引物的，但是要麼反應掛了，要麼產物就是上面沒跑下來的那個超大片段。

首先普及一下實驗常規，PCR圖譜應該標好上樣樣品名、marker大小、目標條帶大小、日期，操作者名字。其次如果沒有你要的產物，檢查模板、引物和酶有沒有用對，最後調整條件重試

(這還是前不久的一道面試題.....)

除marker之外亮的部分是引物二聚體。

作為昔日的pcr磚工，按我的經驗來看，這種豪無smear的條帶應該是啥都沒p出來。

下面你需要檢查幾個部分：

1. 酶和buffer是否過期or配套（聽起來很荒謬，但這是很多人都會犯的錯誤）

2. 檢查引物與模版是否正確……（嗯、根本問題不能錯，尤其是右端引物在設計時有沒有反向互補，推薦傻瓜軟體snapgene）

3. 檢查模板量是否過量，模板過多會導致無法p出來，建議將模板進行10的梯度稀釋，做梯度pcr

3. 檢查引物的結構，ncbi中有相關的工具，雖然我的經驗是不論結構多差只要和模板有10bp以上的重複序列都能p出來。

4. 上述都確定完沒問題依然p不出來請降低退火溫度，嘗試進行溫度梯度pcr。

5. 加少量鎂離子

6. 最後不行的話……把taq換成primestar吧……高保真酶，貴，好用。taq酶p不出來的很多奇怪的序列primestar一上就靈……

最後，你加反應體系的時候攪勻離心了么……暴力實驗的時候我會拿槍頭進去攪攪…防止酶和dntp分布不均……

這個問題為什麼會出現在我的時間線上呢？我為什麼會來回答呢？我明明已經……

引物問題，我遇到過類似情況

前面部分都是用的新訂引物，最後面七個重複試驗仍舊用的舊引物與前面七個DNA模板一樣，其他條件也一樣。結果差異很大

加好陽性對照。瀉藥。

引物不合適，酶不合適，條件不合適，從圖上我只能感覺模板量太多了，我能看到基因組條帶，當然我不知道你上樣了多少。

同學，提問時你應該自己先排除一些問題再來問，比如你確定條件沒錯操作沒問題啥的。

這麼明顯的引物二聚體，說明酶 dNTP buffer等都加了，這些一般沒什麼問題，排除。

做pcr加的也就這麼幾個東西，很明顯是引物不特異或者模板不對。

解決方法

1.換模板重p。模板要麼加錯了，濃度太高或者太低了，要麼降解了

2.針對你的模板重新設計引物，最好設計簡併引物

瀉藥

從膠孔的樣子來看，你的電泳液很臟啊。估計跑了很多膠了。也沒洗乾淨。所以marker孔都有污染帶。

有引物二聚體，說明引物加了。

模板加沒加，酶加沒加。乃至溫度對不對，無法判斷。

老兄，這裡是學生物的。不是學推理的。

給的信息太少。別人咋給你判斷？

你要看看

你pcr之前

是不是

沒離心

哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈哈（苦笑）

抖機靈（其實也不算）完畢

1.看看模板引物加沒加錯，酶以及體系其他成分加沒加錯

2.都沒問題的話嘗試降低退火溫度。實在p不出來降到55℃到50℃都可以試試

補血藥……

陽性呢？水對照呢？看到了疑似引物二聚體的東西也看到了疑似模板的東西但是不確定