熒光定量PCR是用來幹什麼的？

01-26

做熒光定量PCR技術介紹的PPT，知道過程原理了，就是不知道為什麼要熒光定量，網上查到說是什麼mRNA逆轉錄什麼的，反正就是不太懂啊！！

RT-PCR是基因表達分析的神技。比如給細胞或者老鼠加了個化療葯，過了幾天，想看看某原癌基因表達怎麼樣了，在以前的古老時代是做Northern blot，時間要兩天，需要操作放射性元素，樣品RNA容易分解，條帶清晰度對技術要求比較高，曝光不易控制，無法精確比較條帶強度。一塊膠只能上十幾個樣。

現在跑個RT-PCR，半小時逆轉錄，半小時上樣，1小時PCR，一下午就能拿到結果，而且不碰任何有毒有害物質，多好。一塊板子可以上96，有的可以384個樣，一般都做2-3次重複(technical replicates)，一次能做一大堆，還可以幾塊板子連著跑......

數據直出，複製粘貼在excel公式表格裡面就是結果(與上圖並不對應)。

RT-PCR因為相對Western blot, Norther blot簡便快捷高通量，現在已經成為分析基因表達的最基本手段。你看，我要是做了這麼多Northern而不是PCR，光操作這麼多放射性元素，現在肯定已經向孟德爾先生報到去了。這一屏還沒顯示完，右邊還有。如果做Northern，因為一塊膠容量小，數量還要增加十倍

qpcr我在這麼兩個地方用到：

一個是看相對基因表達量。因為是定量嘛，所以能看出mRNA的相對表達量（比如兩種細胞的同一個基因，哪個表達的多哪個表達的少）

還有一個是看基因是純合還是雜合。養老鼠的時候時常碰到後代可能只有一個染色體帶了某特殊基因也可能兩個都帶了，這種時候做普通的pcr然後看亮度相當不靠譜，一般我就qpcr了，帶一個的ct是兩個的一倍

我們實驗室用的是SYBR染料法，用qRTPCR來比較不同處理組間目的基因的表達差異。

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

熒光定量PCR原理熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，後來也叫Real-Time PCR。

原理：隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

熒光定量檢測根據所使用的標記物不同可分為熒光探針和熒光染料。熒光探針又包括Beacon技術（分子信標技術，以美國人Tagyi為代表）、 TaqMan探針（以美國ABI公司為代表）和FRET技術（以羅氏公司為代表）等；熒光染料包括飽和熒光染料和非飽和熒光染料，非飽和熒光染料的典型代表就是現在最常用的SYBR GreenⅠ；飽和熒光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合熒光染料法（SYBR GreenⅠ） SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結合染料，與雙鏈DNA非特異性結合。在遊離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合，其熒光增加1000倍。所以，一個反應發出的全部熒光信號與出線的雙鏈DNA量呈比列，且會隨擴增產物的增加而增加。 SYBR Green I熒光染料與DNA雙鏈的結合雙鏈DNA結合染料的優點：實驗設計簡單，僅需要2個引物，不需要設計探針，無需設計多個探針即可以快速檢驗多個基因，且能夠進行熔點曲線分析，檢驗擴增反應的特異性，低的初始成本，通用性好，因此國內外在科研中使用比較普遍。

熒光探針法（Taqman 技術）：PCR擴增時，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針為一直線型的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5" － 3" 切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。

熒光定量PCR的應用

1 核酸定量分析。對傳染性疾病進行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的檢測 , 比如近期流行的甲型H1N1流感，轉基因動植物基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2 基因表達差異分析。比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學處理等 ) ，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶元或差顯結果的確證。

3 SNP 檢測。檢測單核苷酸多態性對於研究個體對不同疾病的易感性或者個體對特定藥物的不同反應有著重要的意義，因分子信標結構的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，採用這種技術進行高通量的 SNP 檢測將會變得簡單而準確。

4 甲基化檢測。甲基化同人類的許多疾病有關，特別是癌症， Laird 報道了一種稱作 Methylight的技術，在擴增之前先處理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和 Taqman探針來區分甲基化和非甲基化的 DNA ，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。

5 產前診斷：人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，到目前為止，還只能只能通過產前監測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區基因是一種無創傷性的方法，易為孕婦所接受。

6 病原體檢測：採用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優點。

7 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關係。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，隨後若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發生變異。

8 腫瘤基因檢測：儘管腫瘤發病的機理尚未清楚，但相關基因發生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量 PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。