PCR 常用熒光染料的化學結構是什麼？

01-26

PCR核酸檢測試劑中常用的熒光染料，如RTGreen、SYBR Green、EvaGreen等，其核心原料的化學結構是什麼？它們到底是菁基染料、酞菁、方酸染料，還是新型羅丹明？有沒有相關技術說明？FITC - 異硫氰酸熒光素（CAS:3326-32-7）算不算是其中常用的一個？

這是我們在公眾號BioEngX發表過的文章，希望有用。

DNA是無色的，所以我們想要看見它們，就要用到染色技術。自PCR技術成熟之後，DNA染色法被大量開發，我們想用最便宜、簡單而且安全的方法進行最靈敏、有效的染色。我們下面就聊聊幾種常見的染色劑。這些染色劑有的是熒光染料（Fluorescent dyes），有的是非熒光（Non-fluorescent dyes）。熒光和非熒光染料各有優劣，也不能說哪一種絕對的好，要根據情況而定。

1熒光染料溴化乙錠（Ethidium Bromide， EtBr）

EtBr分子結構

最常用、最便宜的DNA/RNA染色劑（結構如上圖）。在瓊脂糖膠里，EtBr的靈敏度是檢測到至少1 ng 的DNA。染色過程可以是通過製作含有EtBr的瓊脂糖膠，或者是在跑完膠後對整個膠體用EtBr稀釋液染色。EtBr在紫外光照射下散發出橘黃色的光，當EtBr與DNA結合後，發光量大大增強。這就是為什麼一整塊經過EtBr處理的瓊脂糖膠，在紫外光下，只有DNA所在的地方會發出強光，而不是整塊膠都強光閃閃。EtBr即給DNA染了色，也標記了DNA，讓我們了解到目標DNA的長短。唯一的不好就是，EtBr是潛在的可致癌誘變劑，所以在使用的時候一定要避免直接接觸，使用有效防護，注意安全。

2 熒光染料SYBR系列Thermo Fisher 出產的SYBR系列主要有三種：SYBR-Green，SYBR-Gold和SYBR-safe。SYBR-Gold有超高靈敏度（最低檢測25 pg DNA），而SYBR-Green靈敏度稍低一些（大概在最低 60 pg DNA），SYBR-safe和EtBr靈敏度相似。不同於EtBr，SYBR系列染料不僅可以被紫外光激發，還可以被藍光激發，因此避免了紫外光可能對DNA樣本造成的破壞或突變。根據名字，我們也可以知道SYBR-safe是安全的、無害的，但另外兩種卻是潛在致癌物，使用時要小心。以前用過SYBR-safe染料，好用是好用，可是貴啊~~~

3熒光類其他染料

Biotium公司的Gel-Red和Gel-Green。兩種染料的靈敏度和EtBr類似，Gel-Red只能被紫外光激發，Gel-Green只能被藍光激發。很多人使用Gel-red是因為它的致癌毒性比EtBr低，而且生產公司的宣稱GelRed無誘變致癌性或細胞毒性（non-mutagenic and noncytotoxic），可事實真實這樣的么？

讓我們先來看看這兩種物質的分子結構：

左邊的是EtBr，右邊的是GelRed（圖片均來自維基百科），本質上來說，一個GelRed就是把兩個EtBr用一條線連接起來。那麼在這兩個分子中相同的乙錠基團部分，就是起到DNA熒光染色的關鍵，也是產生可能誘變致癌的根源。EtBr染色的原理是乙錠基團可以卡在DNA分子的鹼基之間與DNA分子結合，這樣被紫外光照射後發亮的地方，便是DNA分子所在的地方。我認為，凡是這種能和DNA分子結合的化學物質，都是或多或少能影響DNA分子的完整性，進一步影響到DNA的複製等等後續活動，從而導致了可能存在的誘變。

那麼為什麼都說GelRed比EtBr安全很多呢？GelRed雖與EtBr有相同的乙錠基團，但GelRed是用多碳鏈烴鏈接兩個乙錠基團，使得GelRed的揮發性降低，分子極性也沒那麼強（即水溶性不強），也就是說這個東西滴在手上不會那麼快滲入到皮膚里。反觀EtBr，它的揮發性高，水溶性強，當我們在使用EtBr的時候，不管怎麼防護（戴好手套，用上通風櫥），我們都會接觸到低濃度揮發出來的EtBr，這種長期的低濃度EtBr接觸才是不好的。

所以啊，用GelRed的時候也要小心，該帶的手套要帶，該用的通風櫥要用，只要操作小心，應該不會有實驗安全的問題，並不是別人廠商說GelRed沒毒沒危險，你就能拿手在那兒亂碰！

還聽說過Lonza Bioscience 公司的GelStar 和Amresco公司的EZ-vision系列。只是從來沒用過，也不知道效果如何。市面上還有很多熒光類的DNA染料，就不一一羅列了。

4非熒光類染料非熒光染料的靈敏度肯定是大大不如熒光類染料的，但是非熒光類染料無需紫外光激發，能夠減少對DNA的破壞。常見的非熒光染料有噻嗪類染料（Thiazine dyes），比如亞甲基藍（Methylene blue）。除此以外，還有尼羅藍類染料（Nile blue dyes，Nile blue A）。非熒光類染料都是與DNA進行離子鍵結合來顯示DNA的位置的。

圖片來自網路，內容由BioEngX原創，轉載請註明！

回答1：

所謂RT Green，SYBR Green，EvaGreen，前綴都是各試劑公司的註冊商標，比如SYBR就是大連寶生物公司的註冊商標，因此這些染料的化學結構應該都申請了專利，屬於保密內容。具體結構應該是查不出來的。

回答2：

至於你所說的菁基、酞菁、方酸染料，這裡有幾個鏈接，從此可以看出此三類與羅丹明染料的結構類型是截然不同的，相關的技術說明可以到萬方或維普的期刊庫里搜，由於我這裡不屬於教育網IP，所以無法下載全文文獻，你也可以拜託別人查找相關文獻，這方面還是不少的，僅提供兩個百度文庫里的文獻內容。

1. 菁基類：http://wenku.baidu.com/view/8135afd7195f312b3169a52e.html

2. 酞菁類：http://www.cncolors.com/isoc-zl/shownews.asp?id=761

http://tech.2008.sina.com.cn/c/2002-01-15/8438.html

http://walwei.com/dgweb_content-87336.html

3. 方酸類：http://wenku.baidu.com/view/969c65563c1ec5da50e27093.html

4.羅丹明類：http://baike.baidu.com/view/1573058.htm關於羅丹明，百科的這個解釋還是基本靠譜的，所以就採用了。(羅丹明結構可以到百度圖片里搜「羅丹明」即可)

回答3：

FITC是常用的熒光染料，但在實時定量PCR中已不經常使用，已被各試劑公司新推的SYBR Green、Cy3/5等染料逐步取代，這些新一代的染料有著更安全、水溶性更好、淬滅慢等多種優點。

雖說受邀，完全抱學習的心態。就跟問一個川菜廚子怎麼種辣椒一樣。查到一個SYBR Green I 的結構，不知能否能幫到。http://en.wikipedia.org/wiki/SYBR_Green_I