PCR 常用熒光染料的化學結構是什麼?

PCR核酸檢測試劑中常用的熒光染料,如RTGreen、SYBR Green、EvaGreen等,其核心原料的化學結構是什麼?它們到底是菁基染料、酞菁、方酸染料,還是新型羅丹明?有沒有相關技術說明?FITC - 異硫氰酸熒光素 (CAS:3326-32-7)算不算是其中常用的一個?


這是我們在公眾號BioEngX發表過的文章,希望有用。

DNA是無色的,所以我們想要看見它們,就要用到染色技術。自PCR技術成熟之後,DNA染色法被大量開發,我們想用最便宜、簡單而且安全的方法進行最靈敏、有效的染色。我們下面就聊聊幾種常見的染色劑。這些染色劑有的是熒光染料(Fluorescent dyes),有的是非熒光(Non-fluorescent dyes)。熒光和非熒光染料各有優劣,也不能說哪一種絕對的好,要根據情況而定。

1熒光染料溴化乙錠(Ethidium Bromide, EtBr)

EtBr分子結構

最常用、最便宜的DNA/RNA染色劑(結構如上圖)。在瓊脂糖膠里,EtBr的靈敏度是檢測到至少1 ng 的DNA。染色過程可以是通過製作含有EtBr的瓊脂糖膠,或者是在跑完膠後對整個膠體用EtBr稀釋液染色。EtBr在紫外光照射下散發出橘黃色的光,當EtBr與DNA結合後,發光量大大增強。這就是為什麼一整塊經過EtBr處理的瓊脂糖膠,在紫外光下,只有DNA所在的地方會發出強光,而不是整塊膠都強光閃閃。EtBr即給DNA染了色,也標記了DNA,讓我們了解到目標DNA的長短。唯一的不好就是,EtBr是潛在的可致癌誘變劑,所以在使用的時候一定要避免直接接觸,使用有效防護,注意安全。

2 熒光染料SYBR系列Thermo Fisher 出產的SYBR系列主要有三種:SYBR-Green,SYBR-Gold和SYBR-safe。SYBR-Gold有超高靈敏度(最低檢測25 pg DNA),而SYBR-Green靈敏度稍低一些(大概在最低 60 pg DNA),SYBR-safe和EtBr靈敏度相似。不同於EtBr,SYBR系列染料不僅可以被紫外光激發,還可以被藍光激發,因此避免了紫外光可能對DNA樣本造成的破壞或突變。根據名字,我們也可以知道SYBR-safe是安全的、無害的,但另外兩種卻是潛在致癌物,使用時要小心。以前用過SYBR-safe染料,好用是好用,可是貴啊~~~

3熒光類其他染料

Biotium公司的Gel-Red和Gel-Green。兩種染料的靈敏度和EtBr類似,Gel-Red只能被紫外光激發,Gel-Green只能被藍光激發。很多人使用Gel-red是因為它的致癌毒性比EtBr低,而且生產公司的宣稱GelRed無誘變致癌性或細胞毒性(non-mutagenic and noncytotoxic),可事實真實這樣的么?

讓我們先來看看這兩種物質的分子結構:

左邊的是EtBr,右邊的是GelRed(圖片均來自維基百科),本質上來說,一個GelRed就是把兩個EtBr用一條線連接起來。那麼在這兩個分子中相同的乙錠基團部分,就是起到DNA熒光染色的關鍵,也是產生可能誘變致癌的根源。EtBr染色的原理是乙錠基團可以卡在DNA分子的鹼基之間與DNA分子結合,這樣被紫外光照射後發亮的地方,便是DNA分子所在的地方。我認為,凡是這種能和DNA分子結合的化學物質,都是或多或少能影響DNA分子的完整性,進一步影響到DNA的複製等等後續活動,從而導致了可能存在的誘變。

那麼為什麼都說GelRed比EtBr安全很多呢?GelRed雖與EtBr有相同的乙錠基團,但GelRed是用多碳鏈烴鏈接兩個乙錠基團,使得GelRed的揮發性降低,分子極性也沒那麼強(即水溶性不強),也就是說這個東西滴在手上不會那麼快滲入到皮膚里。反觀EtBr,它的揮發性高,水溶性強,當我們在使用EtBr的時候,不管怎麼防護(戴好手套,用上通風櫥),我們都會接觸到低濃度揮發出來的EtBr,這種長期的低濃度EtBr接觸才是不好的。

所以啊,用GelRed的時候也要小心,該帶的手套要帶,該用的通風櫥要用,只要操作小心,應該不會有實驗安全的問題,並不是別人廠商說GelRed沒毒沒危險,你就能拿手在那兒亂碰!

還聽說過Lonza Bioscience 公司的GelStar 和Amresco公司的EZ-vision系列。只是從來沒用過,也不知道效果如何。市面上還有很多熒光類的DNA染料,就不一一羅列了。

4非熒光類染料非熒光染料的靈敏度肯定是大大不如熒光類染料的,但是非熒光類染料無需紫外光激發,能夠減少對DNA的破壞。常見的非熒光染料有噻嗪類染料(Thiazine dyes),比如亞甲基藍(Methylene blue)。除此以外,還有尼羅藍類染料(Nile blue dyes,Nile blue A)。非熒光類染料都是與DNA進行離子鍵結合來顯示DNA的位置的。

圖片來自網路,內容由BioEngX原創,轉載請註明!


回答1:

所謂RT Green,SYBR Green,EvaGreen,前綴都是各試劑公司的註冊商標,比如SYBR就是大連寶生物公司的註冊商標,因此這些染料的化學結構應該都申請了專利,屬於保密內容。具體結構應該是查不出來的。

回答2:

至於你所說的菁基、酞菁、方酸染料,這裡有幾個鏈接,從此可以看出此三類與羅丹明染料的結構類型是截然不同的,相關的技術說明可以到萬方或維普的期刊庫里搜,由於我這裡不屬於教育網IP,所以無法下載全文文獻,你也可以拜託別人查找相關文獻,這方面還是不少的,僅提供兩個百度文庫里 的文獻內容。

1. 菁基類:http://wenku.baidu.com/view/8135afd7195f312b3169a52e.html

2. 酞菁類:http://www.cncolors.com/isoc-zl/shownews.asp?id=761

http://tech.2008.sina.com.cn/c/2002-01-15/8438.html

http://walwei.com/dgweb_content-87336.html

3. 方酸類:http://wenku.baidu.com/view/969c65563c1ec5da50e27093.html

4.羅丹明類:http://baike.baidu.com/view/1573058.htm關於羅丹明, 百科的這個解釋還是基本靠譜的,所以就採用了。(羅丹明結構可以到百度圖片里搜「羅丹明」即可)

回答3:

FITC是常用的熒光染料,但在實時定量PCR中已不經常使用,已被各試劑公司新推的SYBR Green、Cy3/5等染料逐步取代,這些新一代的染料有著更安全、水溶性更好、淬滅慢等多種優點。


雖說受邀,完全抱學習的心態。就跟問一個川菜廚子怎麼種辣椒一樣。查到一個SYBR Green I 的結構,不知能否能幫到。http://en.wikipedia.org/wiki/SYBR_Green_I


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