NgAgo-gDNA 這一技術如果被廣泛證明有效，可以突破目前基因編輯上的哪些瓶頸？

01-19

並且未來可以擴展哪些方面的應用？

先佔坑……等我驗證了再來答

謝邀。

同意大部分回答，但是有一點，簡單地說NgAgo-gDNA的效率更高還有待驗證（不敢同意）。

首先是在原文中作者證明在非GC-rich的區域，NgAgo （31.97%）和Crispr-cas9 （32.2%）的效率是相當的，只是在GC-rich區間，前者的效率更高：

「We compared the efficiencies of NgAgo-gDNA and Cas9-sgRNA systems in cleaving the mammalian genome using DYRK1A gene locus, which has been used extensively to study Cas9-sgRNA. NgAgo-gDNA and Cas9-sgRNA cleaved this locus with comparable efficiencies (Fig. 4e, 31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9). Next, we investigated whether NgAgo-gDNA has advantages over Cas9-sgRNA for targeting (G+C)-rich loci, as RNAs but not DNAs are prone to form secondary structures, which may interrupt binding and normal conformation of Cas9-sgRNAs. Indeed, Cas9-sgRNA was substantially less efficient than NgAgo-gDNA in cleaving (G+C)-rich loci of HBA2 gene and GATA4 gene (Fig. 4f). 」

其次，個人覺得，比較兩者的方法本身就不夠公平。NgAgo guide是以ssDNA的形式進行反映的，而Cas9系統卻是transfect sgRNA 的質粒，而不是以ssRNA的形式。就我有限的知識，transfect ssRNA的效率要大於transfect質粒。當然，從操作上來說，合成ssRNA的難度要大於合成ssDNA。但是從（鑽牛角尖的）科學角度來說，比較ssDNA guide 和ssDNA vector guide的效率，不夠control。

"NLS-NgAgo-pcDNA3.1 plasmid and the indicated ssDNA guides were co-transfected into cells. The sequences of the guides are shown in Supplementary Table 1. Similarly, SpCas9-pCDNA3.1 plasmid was co-transfected with either sgRNA(CMV) or sgRNA(eGFP) vector. The target plasmid pEGFP-N1 was co-delivered with the NgAgo-gDNA system or the Cas9-sgRNA system. After 36 h of transfection, cells were collected, and lysates were subjected to western blot for measuring eGFP expression. Quantification was performed by gray scale scan (image-pro plus), and the relative scales were calculated based on β-actin expression. Anti-eGFP antibody (sc-9996) (used in 1:1,000) and anti-Actin (sc-47778) antibody (used in 1:1,000) were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc."

NgAgo-gDNA是一種DNA編輯方法。據報道，比現有的Crispr-cas9效率更高，需要的鹼基數量更大，脫靶效應少。目前來看，比較保守的應用有：1）在細胞中，高效製造疾病模型，篩查藥物，2）高效製造動物模型，用於疾病機理的研究，更好地篩查藥物。不保守的應用主要在基因治療方面。基因治療方面，最安全的是體外體細胞治療，就是把患者細胞從體內取出，改進後再注入體內，治療血液疾病和免疫相關的問題的效果尤其好。更有挑戰的是體內體細胞治療，直接編輯體內的細胞。生殖細胞方面的治療安全隱患比較多，估計用於人類還需要一段時間。

僅從我常做的序列分析角度來闡述。

引用下文中的內容, 再加上我的補充。

韓春雨：「一鳴驚人」的中國科學家發明世界一流新技術 | 特稿 - 知識分子 - 知乎專欄1. 更大的可編輯的靶位點選擇範圍

目前世界各個實驗室最為流行的基因編輯工具是CRISPR-Cas9。但是，Cas9需要19個配對的鹼基，並且要求在需要編輯的基因組上這19個鹼基後面必須緊鄰一個符合一定特徵的三鹼基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設計，而NgAgo–gDNA系統不需要PAM序列，拓寬了其設計範圍。

DNA編輯的靶位點限制,Cas9雖然比起以前的技術還是極大地放寬，但還是因為為PAM的存在,限制了對某個具體基因可編輯的位置。

例如，某物種可以設計的21nt（單核苷酸）的target位置後接的合適的PAM是NNGRRT，正則可為([CTAG]{21})([CTAG]{2}G[AG]{2}T)。（再次強調僅為在本文作為例子）

Ran, F. Ann; Cong, Le; Yan, Winston X.; Scott, David A.; Gootenberg, Jonathan S.; Kriz, Andrea J.; Zetsche, Bernd; Shalem, Ophir; Wu, Xuebing; Makarova, Kira S.; Koonin, Eugene V.; Sharp, Phillip A.; Zhang, Feng (1 April 2015). "In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9".Nature 520 (7546): 186–191. doi:10.1038/nature14299

在某段DNA上可以設計的Cas9靶位點有下圖紅色短片段有這麼多。

雖然數量已經非常可觀，但考慮到靶標的唯一性（不想編輯到其他基因上），和我們可能想編輯的區域非常小，可選餘地就大大減小了（可能想編輯的區域剛好不可用）。

相比之下沒有PAM序列限制的NgAgo靈活度更大（整段序列隨便哪裡24nt都可以是靶片段）。

2. NgAgo靶序列更長，編輯定位更精確

在幾百上千兆的全基因組中，尋找指定某片段的位置的結果數量， 21nt的結果多於24nt的結果，還是很好理解的，多一個nt搜尋結果幾乎就能少一個數量級。再加上上條所述沒有PAM序列的限制，尋找合適的uniq-target更加容易。

3. NgAgo靶序列配對精確性高

韓春雨團隊的研究還發現，NgAgo–gDNA系統對嚮導序列-靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個鹼基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統比Cas9系統效率更高。

CRISPR剛開發出來的一個缺陷就是「脫靶效應」，因為其21nt的靶序列配對時允許錯配，而導致編輯可能發生在全基因組很多位置上，有可能編輯了我們不想動的基因，雖然現在大家都在用各種方法優化，大大減少了脫靶率。

NgAgo定位配對24nt，定位數量上已比配對21nt的少了很多，如果精確性還更高，難容許錯配也編輯，則大大減小了編輯到不該編輯到地方的可能性。

以上三點總結就是更大的可編輯範圍，更精確的的定位與編輯，可能更小的其他影響。優勢還是比較明顯的。

傳說水很深啊~