斯坦福大學關於人體會對最常用的兩種 Cas9 蛋白有免疫反應的新研究將對基因編輯領域造成何種影響？
bioRxiv 論文：Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans
此文一出，基因編輯公司股價應聲大跌
Uh-Oh! CRISPR Gene-Editing Stocks May Be Worthless
看到消息覺得是要搞大新聞，就去看了預發表的論文。
核心內容很簡單，就兩件事：
1. 健康人普遍存在抗 Cas9 蛋白的 IgG 抗體2. 健康人體內存在一群對 Cas9 蛋白起反應的產 IFN-γ 的 CD3+ 細胞基於此作者認為 Cas9 蛋白對健康人有較強的免疫原性，繼而需要考慮一些相關的安全性問題。
文章內容不複述了，很直白很簡單。直接針對 data 問問題：
首先是檢測特異性 IgG 的 WB 結果，沒有給出一個足以服人的陰性對照，例如這些健康人的自身抗原抗體水平如何？而且靜息狀態的抗體水平並不能直接說明 Cas9 轉入之後的機體反應，有抗體不等於接觸抗原就會引發嚴重免疫反應，也不意味著細胞一旦表達 Cas9 就會被立即清除。
用的 Cas9 表達細胞是臍帶血來源的 CD34+，這裡我要強行抬個杠：作者用髓系幹細胞做 WB 有十足的把握不做 FcγR 的封閉嗎？
然後是檢測抗原特異性 T 細胞的實驗。他們用的是一個叫做 Cytokine Capture System 的方法，就是將抗原直接加入到 PBMC 中，讓 APC 攝取並呈遞抗原給可能存在的特異性 T 細胞，然後看 T 細胞里 IFN-γ 的表達情況。
下面這個圖給的 gating strategy 不得不說有點令人生疑了。看到這個 PBMC 分群我特地確認了一下坐標是線性不是對數……另外最後 CD4 和 CD8 分型的是雲霧圖？我懂我懂！（滑稽）
Harvesting, Storage, and Thawing of PBMCs
PBMCs were isolated from apheresis products, from healthy donors obtained from theStanford Blood Bank, via Ficoll-Paque (density: 1.077 g/mL, GE) density-gradientcentrifugation, according to manufacturer』s instructions. Cells were cryopreserved at 50 x 10^6 cells/mL in CryoStor CS10 (BioLife Solutions) using a rate-controlled container. Cryopreserved PBMCs were thawed for 1 hr at 37C using thawing medium containing RPMI-1640 (GE, Corning, Live Technologies), 30% human AB serum (Corning), and 10 ug/mL DNAse I (Worthington Biochemical Corporation) and then washed with PBS (Life Technologies, Corning) at 300 x g for 10 min.
上面我用紅圈圈出來的估計是死掉的細胞，在這樣一個充滿 danger signal 的體系裡面做免疫實驗，這個材料處理我保留意見。另外就是 PBMC 里表達 INF-γ 的 CD3+ 細胞為什麼會有這麼大一群雙陰？ 我不是專業做 T 的人，求大佬分析一下這一群細胞是什麼。
值得一提的是，在他們後續的培養實驗里，這一群雙陰沒了（話說又換成了偽彩圖）：
我並不是懷疑這篇文章的核心結論，因為這個結論實在是太 reasonable 了，如果他們發現 Cas9 沒有免疫原性那才真是大新聞。就算不看這篇文章，任何一個學過免疫學的人，都會相信外周血里有抗微生物組分的抗體，有一群可以識別呈遞出的微生物短肽的「預備役」T 細胞（不過我確實沒想到 CD8+ 會比 CD4+ 多）。
但是文章的數據存在不少能被攻擊的地方。最關鍵的是，這些結論並不足以挑戰 CRISPER 的安全性：因為抗體水平、潛在的特異性 T 細胞離真正的獲得性免疫反應還有不小的距離——不然 HIV 早就被攻克了，更何況現在動物實驗的結果相當樂觀。換句話說：這篇文章只是把大家都知道的事情套了個 Cas9 的皮，並沒有實錘 CRISPER 的安全性。
不過 Cas9 那邊的股票是已經開始跳水了，感覺一條評論說得很精髓（其實應該是「賣空」）。
@caiweijia ：假如這個斯坦福團隊里的人在文章發表前買空股票，非法嗎？
另外有一說一：
@吳思涵 ：文章中只是拿Sa或SpCas9蛋白用電轉的方式懟進CD34+細胞然後看看相同實驗情況下，跑電泳會不會出現相同位置的條帶。但在那麼多種驗證抗體的方法中，過表達是最弱的一種。。。
我沒太明白「過表達驗證抗體」這個方法是怎麼做的……CD34+ 只是表達 Cas9 的一個載體，換成 293T 乃至酵母都可以，可能作者考慮是 CD34+ 更接近臨床治療的人體靶細胞，這一步的材料選取沒什麼問題。ELISA 是抗體定量檢測的金標準，WB 實驗等於是一個變相的 ELISA（當然它畢竟不是正經 ELISA 因此在定量上問題很大）。雖然我相信這篇文章核心結論沒有問題（但尚不足以從免疫學角度撼動 CRISPER 技術的安全性），不過經你這麼一說，他們純化了 Cas9 蛋白卻沒有做 ELISA 確實挺詭異的……
P.S. 人體臨床安全驗證肯定繞不開，某公眾號那句「其面臨的安全問題不得不增加一個評估環節」實在是……
沒有經過同行評閱的預印論文我是不打算解讀什麼的，因為肯定有很多bug，而且部分bug會在未來正式發表的時候被修復。如果修復不了且影響到主要結論，就會被拒絕發表。暫時不知道這些bug會在科學上造成多大的影響。
但經濟上的影響嘛……給大家直接看圖比較好。用心去感受什麼叫跳水。
想知道這三家公司的領域和金主的，可以看這張圖
作為一個免疫學外行，我希望看到更多有關抗體特異性的數據。文章中只是拿Sa或SpCas9蛋白用電轉的方式懟進CD34+細胞然後看看相同實驗情況下，跑電泳會不會出現相同位置的條帶。但在那麼多種驗證抗體的方法中，過表達是最弱的一種。。。當然啦，由於研究的特殊性，是直接拿人臍帶血或外周血來做的，樣品比較珍貴，量也應該比較有限，很難做嚴謹的翻來覆去的對照。
有答主說，在動物做in vivo editing成功例子好多，似乎免疫反應不是個問題。這裡有一點要注意的是，實驗動物可比人要乾淨得多。而這種預先存在的抗體和T cell，可能是人類之前就接觸過金黃色葡萄球菌或化膿鏈球菌引起的。
既然我們沒辦法在人身上注射Cas9看看會不會引發免疫反應（除非倫理通過，然後做臨床試驗），我們就得另外想個辦法來搞，評價一下會有多大影響。這裡有一個實驗是可以做的是，利用humanized mice，來看看預感染金黃色葡萄球菌或化膿鏈球菌（還有一些親緣關係比較近的人類細菌），看看抗體和T cell產生的情況，然後看看這樣的老鼠對注射Cas9的反應如何。相應地還得做一堆對照組了，就不多啰嗦了。
當然了，我也不是在全盤否定人家的工作，我反而覺得提出這個idea真是幹得漂亮！至少在上臨床之前，就先給打了一劑預防針，省得最後上I期臨床搞死幾個人。雖然I期本身就是做安全性，會有爬坡之類的設計，但提早知道副作用，是有助於預防的。
上面說了，Sa和SpCas9分別來源於金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌，而這兩種細菌真心是太常見了，經常感染人的。所以，有抗體和T cell的存在，根本不奇怪。一些親緣關係近的細菌感染或共生，也可能會引起抗體和T cell的產生。所以，這篇文章反而是幫了CRISPR治療黨一把。真要搞死幾個人了，就不是跌10%股價這麼簡單了。
謝邀。
1.論文的結論是說人的外周血中，存在著針對Cas9蛋白的抗體，也有可以應答於Cas9蛋白的特異性T細胞的存在。
2.文章的結論並不驚奇，其中的證據還要更加強。
3.以血清中存在抗體來講，其中對於印跡的反應陽性判斷，具有很強大的主觀性。（這個問題已經有人指出來了。）
4.用20 ug/mL of either whole purified SpCas9, Alt-R Cas9(IDT) or SaCas9 protein ，來作刺激物作用12小時，然後以ICS作為readout，可以檢測到有IFNg和TNFa陽性的T細胞；並且這些特異性的T細胞在IL-2 擴增下，仍有再次的反應，印證了記憶性T細胞的存在。
5.數據上幾個點：
a. Fig. S5中顯示Ag反應細胞比較少，而在其他的Fig. S6, Fig.S3B的細胞就很多了。
b.以我經驗來講，蛋白的刺激的IFNg陽性百分比的細胞會比用肽段刺激來的少，這在Fig.2B中可以得到體現。而在Fig.2C中，明顯是蛋白刺激會有更多的陽性細胞，這與Fig.2B和一般經驗不太符合。
預印本這篇發現人體內會產生anti-Cas9的抗體，同時Cas9在人體內能被抗原遞呈。
也就是說：體內表達Cas9，可能會引發免疫反應。主要有兩個思考：1. 有效性：Cas9被免疫系統清除，會否來不及工作就完蛋？
2. 毒害性：如果Cas9引起大規模免疫反應，怎麼辦？Cas9本就是微生物來源的蛋白，外源蛋白引發免疫反應也很正常。之前大家只是通過Cas9 knockin小鼠看起來挺正常，猜測Cas9在人體表達沒什麼事，畢竟也沒人體內的相關證據。
現在也是從側面間接提供一些人體內的證據，告訴大家Cas9可能引起免疫反應。但其實，這並不影響Cas9的應用。
有個葯，會引發免疫反應，你就不吃了？通過改變給藥方式，改變藥物的半衰期，可以有效控制藥物的副反應，讓它有效又儘可能安全。從這點來看，這篇預印本對Cas9應用是建設性的，而不是破壞性的，沒什麼大問題。直接在體導入的話，AAV本身就有免疫原性沒有解決，
談Casx還早。
而且Casx對基因的修飾是一過性的，也往往不需要100％修飾，特別是代謝類疾病（也做不到）
離體導入的話，一般是轉入CRISPR-gRNA複合體，導入之後擴幾代就沒有蛋白殘留了。
所以影響應該不會很大。x謝邀~
其實關於這篇文章的內容、意義以及可能存在的問題，前面的答主已經說得很清楚了。這裡就不畫蛇添足了。
想說的是，對於CAS9在人體會有免疫反應這件事，做基因編輯治療的人不需要這篇文章也會考慮。所以實際上，這篇文章出不出，對基因編輯治療本身的研究不會有任何直接的影響，唯一影響的是公眾的輿論和支持研究本身的資金（如前一位答主所說）。
隨便找了一篇文章，2016年8月上線的。。大家感受一下。
像BioRxiv文章里所提到的免疫方面的問題，本來就是做基因編輯治療必須要考慮的問題，也是必須解決的問題。這裡還提出了可能的解決辦法。比如人源化的Cas9等等。
做基因編輯治療從來就不是一件簡單的事情，所有新療法和新藥品的研發也一樣。科學家們需要見招拆招，且不斷重複不斷驗證。很多橫亘在他們面前的問題只是沒有被公布出來，一旦被公布都有可能引起公眾更多的質疑和「大驚小怪」。原諒我這裡用了「大驚小怪」這個詞。
其實同樣的，一些科研上的小突破，也會被公眾過度追捧。
本來微波粼粼的科研領域放大到公眾輿論就是驚濤駭浪！
科研工作者的存在，本就是為了解決這個世界上從來沒有人解決過的問題。
個人認為，輿論需要做的不是博人眼球，而是給予科學工作者們更多的關懷和支持，是教育公眾更理性地去甄別科學相關信息的真假，是引導社會資源更好地配置到真正可以造福人類的地方。
至於公眾，也請豐富自己的知識。對於自己真心不懂的事物，請別人云亦云。
希望未來，那些利用科學相關故事騙取流量以及盲目消費和投資的行為可以更少。
希望未來，社會可以給科研更好的環境。
————————————來自博雅輯因一位小員工
謝邀，
這篇文章主要應該是想說Cas9直接進入人體會被人體適應性免疫應答影響（體液免疫和細胞免疫）。
直接影響：對目前幾家研究Cas9的公司的進展造成一定影響。（其實我覺得說不定他們公司也發現了其實會被人體免疫系統影響，但是還在找對策）
對基因編輯的研究方向（我不是這方向，純當我瞎扯好啦）：
- 可能會從Treg細胞的免疫抑止來抑止人體免疫系統對Cas9的免疫反應；
- 可能可以人工修改cas9蛋白結構，使得改造後的cas9在保持功能不變的情況下，失去被抗體識別的表位。
- 由於不是所有donors都有對cas9的抗體，說不定可以深入下去看看是為啥，說不定澳洲的細菌的cas9不會被其他幾個洲的人免疫系統識別。但是如果是通過pamp序列導致的免疫反應可能就沒辦法；
- 我想可能馬上官方也會出來發一些東西防止股票下跌吧。
好像這種蛋白對未來腫瘤防治的研究，非常有意義。
這篇Paper的論據足以證明Cas9在人體里一定會被target嗎？一定不會起作用嗎？
答案是 不足以
在沒有人體的Cas9臨床數據之前，一切都只是討論和猜測。
Cas9在基因編輯領域上是非常有前景的。
假設Cas9在人體中被免疫系統降解了，而不起作用，那麼大家也會找到讓immune tolerance的辦法。
回到原點，趕緊做Cas9臨床實驗啊！！！！
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