為什麼雙鏈文庫模板只有一條鏈可以結合到flow cell上？

01-15

Illumina文庫最後為dsDNA，一條鏈5端為P5接頭，3端為P7互補序列；另一條鏈5端為P7接頭，3端為P5互補序列。
變性分開成單鏈後可以雜交到flow cell上的P5，P7接頭，進行初始模板合成。如果，dsDNA文庫的兩條鏈都能合成初始模板的話，那麼經過橋式PCR以後，就會形成兩個一模一樣的簇，那麼最後測序就會得到Duplication，那麼理論上Duplication就會是50%了。
從原理圖上看，flow cell上只有P7接頭可以合成初始模板，P5接頭不能，請問P5序列有什麼處理讓其不能合成初始模板？（SE P5的diol，PE P5的U，P7的8oxo-G是用於橋式PCR後的切除，不要混淆）

我說一下我看到的，不一定對（如果有 @趙柏聞說的block的話）

有更靠譜來源之後我就改答案。

首先題主說的這句話非常關鍵

（SE P5的diol，PE P5的U，P7的8oxo-G是用於橋式PCR後的切除，不要混淆）

1，兩條鏈是不是都可以雜交在上面？

我認為是

圖片來源The MGH NextGen Sequencing Core

illumina的宣傳材料裡面都是用兩種不同顏色的oligo來說P5和P7，illumina在演示hybridization的時候只用一條做演示，也並沒有強調只有一種才可以雜交上。

如果去看非官方文件，這個圖解裡面有說明，兩種都會雜交上，都會進行擴增。

The P5 and P7 regions of single-stranded library fragments anneal to their complimentary oligos on the flowcell surface. The flow cell oligos act as primers and a strand complimentary to the library fragment is synthesized.

兩種鏈各自進行擴增，一旦擴增開始就沒有任何區別了，形成cluster之後，會切掉P5鏈，洗掉cluster中一半的鏈，只對另外一條進行測序。

當然測序之前需要做block，但這個block並不是另一位答主說的那種特異性加上的

2，會存在兩條都測到的情況嗎？需要擔心50%loss嗎？

我認為有概率，但完全不需要擔心

首先，當然如果你建庫的起始量很小，PCR本身會造成大量的duplicate。

關鍵是能進行clustering的，只是很小的一部分，對於一條dsDNA，它的Watson和Crick同時結合上去的概率很小，大部分都是在flow cell裡面走個過場被洗掉。

貼一個denature的protocol：

如果要看詳細資料，可以去查cBot的手冊，這個是簡介https://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_cbot.pdf （cluster不一定是在Hiseq上做的，可以在cBot上面做完再把flow cell插到Hiseq上）

3，這樣說有沒有依據？

我反正是沒找到直接的證據，但是，如果要是有block，那必須有加block和去掉block的過程，也就必須在cluster這步有流程，我反正是沒看到。

貼一個cluster的全部流程：

來源：Cluster generation on cBot

這就是最詳細的機器讀到的代碼了！（前幾行是Hybridization）

& TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HT1, AspirationRate=60μl/m, Volume=120μl TempRamp (96°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=Template, AspirationRate=15μl/m, Volume=75μl Pump Reagent=Template, AspirationRate=100μl/m Volume=10μl Wait Duration=30000ms TempRamp (40°C, 0.05°C/sec) Pump Reagent=HT2, AspirationRate=15μl/m, Volume=75μl & "Extension-Amplification" Pump Reagent=APM, AspirationRate=15μl/m, Volume=70μl Pump Reagent=HFE, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl TempRamp (74°C, 0.9°C/sec) Wait Duration=90000ms TempRamp (20°C, 0.9°C/sec Pump Reagent=HP5, AspirationRate=60μl/m, Volume=75μl Pump Reagent=HT2, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl TempRamp (60°C, 0.9°C/sec) "Amplification 1", Cycles=17 Pump Reagent=AT1, AspirationRate=30μl/m, Volume=20μl Pump Reagent=APM, AspirationRate=30μl/m, Volume=20μl Pump Reagent=AMX1, AspirationRate=30μl/m Volume=32μl "Amplification 2", Cycles=18 Pump Reagent=AT1, AspirationRate=30μl/m, Volume=20μl Pump Reagent=APM, AspirationRate=30μl/m, Volume=20μl Pump Reagent=AMX1, AspirationRate=30μl/m, Volume=32μl "Amplification-Wash" Pump Reagent=HT2, AspirationRate=30μl/m, Volume=120μl TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HT1, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl & TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=LMX1, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl TempRamp (37.9°C, 0.9°C/sec) Wait Duration=1800000ms TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HT2, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl & "CombinedBlocking 1" TempRamp (38°C, 0.9°C/sec Pump Reagent=BMX, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl "CombinedBlocking-CyclicPumping", Cycles=9 Pump Reagent=BMX, AspirationRate=15μl/m, Volume=5μl Wait Duration=180000ms "CombinedBlocking 2" TempRamp (60°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=BMX, AspirationRate=60μl/m, Volume=25μl Wait Duration=900000ms "CombinedBlocking-Wash" TempRamp (20°C, 0.9°C/sec Pump Reagent=HT2, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl Pump Reagent=HT1, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl & "Denaturation-Hybridization" TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HP5, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl Pump Reagent=HT2, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl Pump Reagent=HP1, AspirationRate=60μl/m, Volume=95l TempRamp (60°C, 0.9°C/sec) Wait Duration=300000ms TempRamp (40°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HT2, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl TempRamp (20°C, 0.9°C/sec) Pump Reagent=HT1, AspirationRate=60μl/m, Volume=95μl & Pump Reagent=Air, AspirationRate=60μl/m, Volume=40μl

可以看到，這個操作過程跟動畫裡面差不多。但是就是沒有在hybrid之前對P5加blocker的流程，只有擴增之後再加block的流程，這個不能實現題注的想法。

也沒有相關的只對P5加block的神奇試劑。但可以使用單鏈對flow cell上的P5進行飽和，不知道illumina的試劑裡面有沒有這個東西。illumina賣的試劑盒肯定都不會告訴我們成分是什麼的，所有的教程也都是原理上敘述一下，也不會把技術過程和盤托出。

綜上，我覺得不出意外對於同一條雙鏈的Watson和Crick應該是一視同仁的！

一點拙見。

1. 文庫的製備（簡短流程）

片段化隨機打斷－末端修飾－加A-加接頭-片段選擇－擴增－文庫質控

注意這個地方是文庫是隨機片段。

2.上機之前cbot製備－即將文庫長到FC上。hiseq2000測序過程和cbot是分離的。

在CBot上進行cluster生成的時候，模版雜交-延伸之後變性用NaOH將雙鏈變成單鏈，然後進行擴增。這個過程隨機的片段文庫是變性成單鏈了，就是包括正、負鏈。

p5，p7是有可能都長到fc上的，可以理解為兩種鏈一起進來只是一個形式。但是最後有個線性化的過程，會把p5端切掉。保留一個單鏈進行測序。

cbot過程所用試劑如下：

3。那麼再看duplication的問題。

剛一直提到 文庫是隨機的片段，當然文庫測到重複肯定是存在的，但這並不是全部測的一樣的概念。

假設測pe50，就是雙端測序測50bp，文庫是基因組打斷的，就是這段是50-100，那段是150-350，還有一段是450-900，這樣的概念，那麼我們測100bp，只不過是從基因組不同的地方測了100bp，所以下圖看到的藍色的一樣的鏈其實是不一樣的。。。so，這種測到重複的概率不是50

％。

而真正跟與重複相關的是pcr次數，特殊文庫如pcr－free文庫，或者文庫較短，測序長度超過文庫全長（pe300，文庫只有150.）還有可能是樣本起始量很低，容易產生相同的reads。cbot擴增也會有dup。等。