第四代測序（納米孔測序）有望全面代替邊合成邊測序嗎？

01-14

個人覺得不會。

目前納米孔究竟算三代還是四代，說法尚不統一。下面對此不加以區分，統一稱為三代。

二代測序如此成熟的今天，一代測序也沒有消失。你要是構個載體，直接18塊錢做Sanger測序，24小時拿到結果，何必做二代測序燒錢？

同樣，如果三代測序成熟了，只會造成測序市場的進一步細分，而不是完全取代二代測序的地位。

至於市場將會如何細分，因為三代畢竟尚未成熟，所以只能猜測。二代測序的代表Illumina的晶元就是一塊平整的流動單元（flow-cell），只要晶元保持足夠平整，提高通量很容易（HiSeq X10的通量已經令人恐怖了）。納米孔測序對製作工藝的高要求，很難保證每個納米孔高度一致，因此其通量可能很難提高；而即使納米孔的工藝改進，使得通量達到數十G的級別，二代也會進一步改進，通量估計繼續甩三代兩個數量級問題不大。因此對某些需要極高通量的測序項目，二代測序會繼續保持優勢。

以下是根據目前測序技術的現狀和趨勢，作出未來幾年可能發生情況的推測：

二代測序的通量會進一步穩定提高，讀長也會相應增加但不非常顯著。三代測序的準確度提高到可以接受的水平（起碼得到95%）。
在1的假設下，二代測序可能繼續保持優勢的領域可能是全民級別的基因組、某些重要組織的轉錄組的測序。如果基因組測序會進一步普及和平民化，則二代測序由於通量大，因而成本低，更容易被市場接受。測序的準確度可以由通量來保證。而基因組上的低複雜度區域（重複序列），可以選擇不關心，因為那裡存在重要SNP的概率比較低。
在1的假設下，三代首先會奪去的市場可能是單細胞測序，和醫療、司法、海關等不要求極高通量的生物檢測應用。目前用二代測序做單細胞測序，無論是測基因組還是轉錄組，都需要先擴增再測，而擴增不可避免地會引入偏差和錯誤。而三代測序則先天性可以避免擴增，直接測單細胞，這是二代測序無法比擬的優點。醫療上檢測病人樣品，司法上檢測兇手DNA等，都不需要二代那樣龐大的通量，而要求快速、靈活和超長讀長，這也是二代難以抗衡的。

但說實在的，三代先把準確度提高了再說吧，不然對二代來說都不是個事兒。

考量一種測序技術主要有以下幾個參數：通量，讀長，準確度，單位成本。而單位成本一般可以簡單認為和通量成反比，所以簡單點就直接考慮前三個因素就行了。

其中讀長和準確度都是越長越準確越好，但通量就要看情況了，Sanger測序之所以還在用，一方面是其讀長較NGS長，準確度好，另一方面也是因為其通量低，操作簡單快速成本低，這使得Sanger測序在某些應用上有其特有的優勢，試想某個研究項目中我只想知道某個300bp的外顯子的序列，難道還非得用NGS去測嗎？當然如果有一天NGS發展到測完整個exome的成本、時間、準確度都比Sanger測一個外顯子還有優勢的時候，估計Sanger測序也就沒人用了。

納米孔測序也同理，包括PacBio的單分子測序（還有Helicos，不過貌似破產了），這些單分子測序目前最大的優勢是讀長很長（Helicos除外，難怪破產orz），但通病是通量低、準確度低（注意這幾個平台的測序錯誤與NGS的不太一樣，其測序錯誤都是隨機的，也就是說理論上可以通過循環多測幾次來矯正，所以準確度低從根本上來說是通量低）。從這個角度看，如果單分子測序的通量能夠跟上NGS，那全面取代NGS是早晚的事；如果不行，那隻會在某些需要通量不高的應用中逐漸取代NGS，而對於諸如腫瘤這種需要極高通量的somatic測序項目要取代NGS則不太可能（除非通量跟上去）。

謝謝邀請，納米孔單分子測序（更傾向於被稱為第三代測序技術）理論很美好，現實還需努力。

納米孔測序相對SBS的主要的優勢：

首先速度快，最快24小時完成樣品建庫到測序數據收集，鹼基讀取速度即酶自身的合成速度。

其次單read讀長超長，讀長可超過10K，方便數據組裝。

然後文庫構建簡單，無需PCR，避免了建庫過程中可能引入的錯誤，得到的是最原始的DNA序列信息。

然而，目前這些優勢實現的還不太順利。

現在二代測序技術相對成熟，巨頭公司還在不斷升級自家的測序平台，推出性價比更高功能更強的儀器，三代測序公司也在為了更好的實現其理論描述的種種優勢繼續研發。

如果三代測序技術真的實現了它描述的這些優勢（醫療檢測急需啊），完全替代二代測序是肯定的。

先等技術可靠了再說吧。聽說納米孔的錯誤率暫時還無法直視。

短期內，乾的活不一樣，互相不能替代。

Nanopore Sequencing測得長，但是錯誤率也高。錯誤率高可以慢慢降低，但是有一個問題是短時間內解決不了的，就是建庫的時候，如果建庫長度長，那麼定量就會有很大bias。所以，所謂4代測序，現在定性目標是可以達到的，定量還差一些。
二代測序定量一般很准，當然也有很多bias，但是有一套成熟的流程支撐。

長期來看，

如果建庫，測序，分析整個水平都提升上來，價格再降下去的話，二代市場會擠壓很多。但可能都是5到10年以後的事情了。

開個腦洞，

最理想的狀態下，是1個活體細胞，扔到Nanopore裡面，裡面所有的DNA，RNA，蛋白質全部定量，全部測序出來。

以上。

未來三代測序不會完全取代二代測序。

即使是現在的二代測序也沒有完全取代一代測序，對於&<100kb的片段，我們依然使用Sanger法的一代測序方案。

二代高通量測序和三代單分子測序的區別可以用「吃米飯」和「吃麵條」來形容。

二代高通量技術像吃米飯，一粒粒的很短，但是同時能吃很多粒；三代測序技術原理有點象在吃麵條，抓住一頭一吸，從頭讀到尾，一次只能吃一根。（實際肯定不只一根，但比二代要少）

有些研究比如基因組測序就是越長越好，對於讀長的要求高於對通量的要求，肯定是「吃麵條」的三代更合適。而有些研究則更適合吃米飯，比如免疫組庫的測序就需要對幾十萬個T細胞或B細胞受體進行檢測，這種情況肯定是「吃米飯」的現有二代測序更好。

所有究竟使用哪種測序技術需要依需求而定。

二代示意圖

三代示意圖

其實以前我比較推崇的一種測序方式原理介於二代和三代之間，不打斷長序列，而是利用探針進行分段同時測序，既滿足高通量也滿足長度長的需求

下個月10號PacBio來我們學校做報告兼演示，可能還有上機，回來了向大家報告。由於我自己不是做基因組的，有錯誤的地方請大家指正。

12/10/2014

聽完報告回來了。這個是這次報告的鏈接PacBio Workshop, December 10, 2014

第一位是PacBio的科學家，他們的技術稱做Single Molecular in Real Time(SMRT)，幾個要點

不需要PCR，直接測序單個DNA分子
讀長很長，在10kb級別甚至更高
Contig的數量大幅下降（可以到只有一個），小型基因組可以做到封閉（這個有什麼術語嗎？）。
測序速度快，1-4小時

第二位是南邊MayoClinic的科學家，現在明大的樣品是送到那裡去測

他提高了價格，大概是$342/Cell，這裡的Cell就是SMRT Cell，相當於illumina的lane.
明大的樣品要Fedex過去。
機器好大。。。

第三位是明大Super Computere Institute（MSI）的。主要介紹了MSI提供的分析工具，基本上半自動了。這部分這周五有上機，回來我再補充。

不知道誰提到了一點，雖然illumina的讀長短，但準確度略高於SMRT。所以也有人講SMRT和illumina測序結合起來組裝基因組。

之後的幾位都是明大的教授了，大家基本上都是說SMRT在自己研究領域的作用。超長的讀長可以顯著降低基因組組裝時的不確定性，應該是未來的方向。但目前SMRT的通量還不高，一個Cell只能夠組裝微生物的基因組，但是PacBio也在實驗新的試劑，可以提高通量。

大致就是這樣了哈。過兩天MSI會把PPT貼出來，大家想看我就傳上來哈。

回到問題上，我覺的目前PacBio已經可以替代小型基因組的測序了，至少可以配合illumina一起使用。但是像我這樣做amplicon測序的，還是illumina MiSeq更合適。

我來烏鴉嘴一下。Nanopore將是繼Helicos之後，又一家將要破產的測序技術。

根據1月6日，最新的一份評測paper：http://biorxiv.org/content/early/2015/01/06/013490 。

作者百般支吾掩飾，但終究無法掩蓋一個基本事實：單純的使用Nanopore Reads，甚至無法組裝起一個酵母基因組。(paper里是使用了MiSeq reads來輔助nanopore的組裝)

目前Nanopore沒有任何一項參數可超越PacBio，兩者的定位又相似，故有本答案第一句的預測。Nanopore相對於PacBio優勢在於儀器（耗材不確定）成本與體積，但PacBio對於Nanopre的絕對優勢在於，Nanopore無法象PacBio那樣利用循環重測同一分子來提高準確率。

附帶參考Homolog對上述文章的評論：Oxford Nanopore Sequences are Very Noisy

實驗室有幾個納米孔,也做了很多測試,確實相對於二代的儀器來說,測序結果很糟糕,往往不能作為標準性的數據。

優點在於測序速度很快,而且可以做實時的分析,一邊測序一邊分析結果就可以處理出來。但準確度無法和二代相比,誤差很大。

不過牛津一直在更新晶元和技術,準確度的問題也一直在變好。我比較相信還是有很大的發展空間。

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更新最近進展

首先,納米孔的測序精度已經有大幅提高,從大概80%提高到98%左右,雖然和二代相比還是有差距,但是可以通過後續的分析進行改進,現在已有很多演算法通過對比read之間的差異,對read進行矯正,提高測序精度,可以達到99.5%,現在廣泛的做法,就是結合二代和納米孔技術,整體提高測序能力

其次,納米孔長read相較illumia的短read來說,其作用大很多,可以用來檢測基因組的重複區域,以及腫瘤基因組的複雜重組問題,而且對於基因組拼接也有很大幫助

另外,現在納米孔可以用於RNA測序,能夠直接測序出完整的轉錄本,這是二代無法比擬的

最後,MinION太便攜了,口袋裡一放,就帶走了,非洲埃博拉肆虐的時候,伯明翰的Nick Loman直接帶著它去非洲測序分析,大大降低了時間成本

當年隔壁實驗室做的就是這個課題的，他們是通過TEM的電子束打穿一個薄膜而製作相應的器件。平時聊天時也討論過這個技術的可能性，好像加州有幾個startup也在試圖做這個。

目前的瓶頸好像在於如何準確的控制一條DNA鏈穩定通過這個納米孔，並且能夠得到可分辨的準確信號。但是不僅理論上還有很多問題沒有解決(所以我同屆的一個同學目前還沒有畢業…)，並且在納米量級的器件工藝整體還在發展中。我的理解就是，能把DNA鏈牽著穿過那個小孔的「鑷子」現在還造不了那麼小，現在用來觀察每個鹼基對的「放大鏡」還看不了那麼清楚。這好像也是整個納米科技行業目前所面臨的問題。

這兩年我們組倒是為單分子實時測序做了一點點貢獻（測了10來個細菌，1個真菌），感覺吧，拿來做重測序肯定是沒必要的，de novo效果還不錯。成本再降點，市場應該比現在大，但應該不會全面霸佔市場，針對不同的項目，對數據的要求，成本的控制均是不一樣的。只是多一個選擇吧。

大家都在潛伏，等待全面取代那一天；這之前呢？先好好用二代賺錢吧

是極大可能的，現在還受限於硅製作工藝決定了通量。就等上游產業驅動，未來兩年吧

dna分子過長後，是處於纏繞的狀態，在測序的過程中，怎麼保證不打結？