顏寧教授解析 GLUT1 的晶體結構這件事有多大的影響？

01-14

這個事是真的嗎？有多大的技術含量？能得到諾獎嗎？離我們有多遠？

更新：加了一條解釋GLUT1意義的鏈接。

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1. 這件事是真的。

http://www.nature.com/nature/journal/v510/n7503/full/nature13306.html

下文中引用內容部分來自本文。

2. 技術含量有多少？

技術含量有多少不好說。但是工作量一定非常大。

顏寧老師採用的X-ray crystallography是結構生物學最常用的手段，即：獲得大量有活性的蛋白-摸索條件結出蛋白質晶體-X射線衍射，根據衍射圖譜用數學物理方法解結構。

（其實在顏老師的paper裡面就有寫啦，method裡面的小標題：

Protein expression and purification
Crystallization
Data collection and structure determination

這就是他們為了獲得結構所做的工作。

為什麼要獲得人源GLUT1的結構？

因為得到了蛋白質的結構，就得到了蛋白質的活性位點，就有了潛在的藥物靶點。

GLUT1的意義已經有回答提到了，這裡暫且不表。

關於GLUT1的意義，詳情請戳這個答案：

如何評價人民網新聞：「清華大學研究組全球首次獲取人源葡萄糖轉運蛋白結構——餓死癌細胞或成可能」？

很多藥物的作用機理是抑制蛋白質的活性。現在的藥物設計中，一種正在發展中的手段是，通過蛋白質的活性結構和小分子對接，對接成功的小分子及其類似物投入進一步的活性檢測，最後進入臨床測試階段。

啥叫分子對接？一張圖說明這個問題。

下圖是HIV protease和藥物小分子saquinavir對接的結果圖：

自己做的對接……獻醜了……

藍色的卡通圖表示蛋白質HIV protease，是艾滋病毒侵染細胞後自我複製所必須的蛋白。綠色的sticks是藥物分子saquinavir。

可以看出來，本來這個蛋白質中間有個「口袋」，是蛋白質有生物活性的部位，「生物活性」在這裡可以理解為HIV病毒作怪的能力。在正常的HIV病毒裡面，這個蛋白質的口袋裡應該裝的東西，就是所謂的底物。現在這個口袋裡卻被人為地裝進了一個奇怪的東西（藥物分子saquinavir），而且蛋白質還對這個奇怪的東西非常中意……所以，蛋白質該發揮作用的底物就進不去口袋了。也就是說，HIV protease的生物活性被saquinavir抑制住了。艾滋病毒就無法在人體繼續複製了。

分子對接聽上去很容易，就是設計出一個奇怪的東西裝到蛋白質的口袋裡嘛。

實際上，首先你要有一個蛋白質結構……

光是這一步就非常困難了。它的難點在下文會有詳細的解釋。

其次，你要確保這個小分子物質不會誤傷友軍啊！萬一它在抑制病毒里蛋白活性的同時，一不小心把自己身體里有重要作用的蛋白活性抑制了……那就不是治病了啊，那是殺人。

但實際上，「不誤傷友軍」是非常理想的情況。大多數情況下，市面上的藥物小分子都會或多或少地同時對人體里其他蛋白有抑制作用。只不過這些抑制作用對人體損傷相對不是很大，所以葯還是可以繼續用。勉強算是「是葯三分毒」這句俗語背後的科學原理吧。

為了確保你用計算機模擬出的藥物小分子實際上也有用而且不太會誤傷友軍，後面還要進行一系列實驗室里的生化試驗，再去進行很多很多很多的臨床試驗……通常要花幾年時間甚至幾十年。

這就是所謂的，從基礎研究到臨床應用之間的距離吧。

如果在實驗室里，顏寧老師和他的學生們的日常會是什麼呢？

註：以下並不是我自己憑空YY的內容，X-ray crystallography是一個非常成熟的技術，也就是說，他們做的事情是非常模式化、標準化的。我自己在一個解結構的實驗室里也做了一年有餘。

從蛋白質的獲得談起。

The recombinant GLUT1 was expressed using the pFastBac baculovirus system (Invitrogen). Briefly, bacmid DNAs were generated in DH10Bac cells, and the resulting baculoviruses were generated and amplified in Sf9 insect cells (Invitrogen).

為了獲取足夠多的GLUT1用於結晶，顏寧老師實驗室採用昆蟲細胞表達系統表達人源蛋白，意味著實驗人員會花很多時間在培養昆蟲細胞上。

表達外源蛋白的方式有很多種，包括用大腸桿菌表達、酵母細胞表達，昆蟲細胞表達。用昆蟲細胞表達是最辛苦的。

養細胞是挺辛苦的一件事，因為一段時間內，實驗室里的工作人員需要幾乎每天都需要花一段時間去照顧細胞。身邊同學寒假在養昆蟲細胞，大年三十還得從家裡趕到學校，否則細胞死了，蛋白沒了，什麼實驗都沒法做下去。

昆蟲表達系統和之前提到的大腸桿菌、酵母表達系統相比，培養基貴、細胞難養活，而且表達效率還相對低下。表達效率低下的意思就是，你需要養活很多很多細胞才能獲得一點點蛋白……但是由於人的GLUT1又是膜蛋白、又是真核細胞蛋白，大腸桿菌和酵母這麼低端的生物很可能是hold不住的，用它們表達的蛋白很可能沒有生物活性。所以沒辦法啊，辛苦也只能這麼做。

接下去是蛋白純化，沒什麼好說的，用的是普通的柱層析方法。

好了，我們辛辛苦苦養細胞，獲得了大量外源表達的蛋白，然後呢？

要結出蛋白質晶體啦。

蛋白質的結晶條件很苛刻。

大家知道的食鹽（NaCl）晶體非常好獲得，只要得到過飽和溶液，假以時日晶體自然會結出來。

但是蛋白質這麼複雜的東西，尤其是膜蛋白，僅僅讓它過飽和可不夠，很可能它就傲嬌地直接沉澱了……需要加入很多其他的物質，包括維持pH的緩衝物質、一定濃度的鹽，甚至還要有一定濃度的去垢劑。而且為了保持蛋白質的穩定，通常要在低溫條件下結晶。這些複雜的條件，改變少許，也許本來能夠結晶的蛋白就結不了晶，或者結出來的晶體不夠大，不能用。對於蛋白的結晶條件，有一些大概的指導方向，但是卻沒有確定的公式般蛋白-結晶條件的關聯。換言之，為了得到晶體，我們只能不斷重複，不斷嘗試。

下面是顏寧老師發的paper中的描述：

Most of the efforts failed to yield crystals. Finally, the full-length GLUT1 containing two point mutations N45T and E329Q purified in the presence of 0.4% (w/v) β-NG gave rise to crystals through hanging-drop vapour diffusion method in the well buffer containing 30% (w/v) PEG400, 0.1?M MES pH?6.0 and 0.1?M MgCl2 at 4?°C.

Most of the efforts failed...這短短的一句話背後，可能是成千上萬次失敗的經驗。絲毫不誇張，因為每次篩選蛋白質結晶條件，需要點24或96孔板，每個孔里就是不同的結晶條件的蛋白。每個孔里都要精確地加入不同種類不同濃度的上述物質，然後就是漫長的等待。每天在冷房裡的顯微鏡下挑晶體。如果這些條件都失敗了，蛋白又用光了，只能從頭再來……幸運的，可能幾個星期就拿到晶體，不走運的，可能半年一年都顆粒無收。

很難形容終於看到一個足夠大的蛋白質晶體時的激動感。

最後的部分是用X射線衍射，收數據，處理得到結構。

這部分主要是數學和物理知識的運用，相對整個過程而言花的時間不是太長。當然也有衍射後發現晶體不夠好，得不到結構，還要從頭再來的……也要經過很多trial and error，不過相對之前的部分而言是腦力活動多於體力活動，重複勞動比較少。

不知道大家覺得這算不算有技術含量？

3. 能不能得到諾獎？

私貨時間：個人覺得離諾獎還有距離，雖然是提供了一個很重要的治療癌症的靶位，但是和解析核糖體結構什麼的相比，總覺得還差了點什麼。

4. 離我們有多遠？

有很長一段距離。具體請見第二部分。

從結構到藥物，真的還有很長一段路要走。

解出膜蛋白的三維結構上 Science、Nature 之類的很正常，單憑這個得諾獎就扯得得有點遠了。

這個事是真的嗎？

毫無疑問。看來題主是時候關注一下清華結構生物學的進展了。個人認為走在世界前列一點不算誇張。

有多大的技術含量？

這是一篇Nature Article，我想足夠說明含金量了。

能得到諾獎嗎？

如果只考慮這一項工作，應該很難，因為甚至不是這一期Nature的封面文章。但是考慮到顏寧老師課題組在該領域已有的和將有的重要發現及貢獻，這至少在未來值得討論。

離我們有多遠？

看怎麼理解，這是人類大多數細胞主要的葡萄糖轉運體。

有興趣可以讀一下顏寧老師這篇博客，其中藍字部分為GLUT1相關。

科學網—結晶--藝術？

我不做結構，但是會繼續關注相關工作。

不是做結構的，但見得聽得多了，也知道一點。不知道為什麼炒這麼火，有些莫名其妙。

我同意@steven zhou的看法。這個工作不容易，意義被媒體過度解讀，技術是常規技術，就是砸人砸錢砸時間，這個領域的特點，反正國內學生便宜，這些單位也經費充足。一堆蛋白，一堆學生，總有能砸出結果的。

就這水平還被人到處轉呢? 連蛋白結構什麼作用都不懂的東西你相信他剛黑了FEI的網站?

貼個我的答案

到在老美這裡博士後炒lab或者lab炒博士後的常見的跟吃飯一樣。絕大多數跟水平沒什麼關係。我見過跟lab manager不和撂挑子走人的。見過和老闆觀點不和分手的。見過對所在城市/行業不滿意跳槽或者轉行的。當然老闆不會說手下人離開是自己缺乏遠見或者資金不夠或者太小氣，說沒有達到預期的要求是個非常簡單明了又給老闆面子的說法。畢竟在一個實驗室干不下去換到其他實驗室出彩例子實在是太多。

順帶也看出當年仰望的台灣，現在簡直見識短淺的一塌糊塗。身邊的台灣人很多，絕大部分都是好人。但是發現在他們身上能學到的東西是越來越少。從發展加速度上比，跟目前大陸完全不是一個水平。回國的兄弟姐妹們一天到晚感覺會被人追上，這種積極的態度完全在台灣人身上看不到。你可以用「慢點走等等你的人民等等你的道德水平」之類的說法來麻痹自己，我只想說，你走的速度和你道德水平增長並不是反比關係。

回到正題：施一公再流水線作業，那也不是普通水平的重複，有本事你照著文章套個其它蛋白髮CNS去？鍵盤俠都以為上嘴唇碰下嘴唇這實驗就搞出來了，尼瑪隨便一點小細節坑你半年算清的。實驗就像武功，一點一滴積累下來，無數錯誤和不眠夜鋪出來的。你笑話施一公一招鮮，你去弄一招看看唄。我們老闆最近在試圖搞定一個PD帕金森相關蛋白的結構，已經搭進去差不多100多萬刀，換了兩個Postdoc博後/Technician技術員，還沒搞定。你說這個簡單是流水線作業，你給我流個看看？

前頭那個匿名答案給我的感覺就是個文革穿越回來的撿了本《讀者》如獲至寶的水平。我毫不掩飾我鄙視成年人還靠著給人取外號獲得快感的行為，但是這個跟他嘴裡那個"洋大人」在背後下一盤大棋的土鱉思想相比簡直純潔的可愛。

「電鏡商負責做CNS的工作」——雖然說nature偏愛新奇技術是眾人皆知的，但是你直接拿鄉鎮企業請人洗澡這個套路來套NPG，CellPress也就有點相當搞笑。一台電鏡也就是500萬美元左右，清華也就買了三台。我的Cell editor編輯老闆一年來自私人的捐款就不止這個數字。這還不包括來自federal聯邦像NIH，DOE基本上同樣水平的資助。更多來自industry工業界的就不說了。

退一百步說，就算是FEI把清華所有的銷量（連本帶利都搭上）都拿來賄賂，一個（這裡說的真是單數）cell editor編輯都搞不定。

退一千步說, 你搞定了編輯，那些匿名的reviewer評審你怎麼辦, 人家還都是大牛，價碼不低啊。

退一萬步說，你搞定了一堆cell 的reviewer評審，還有nature+science的怎麼辦？

退一億步說，你搞定了CNS所有的編輯+reviewer當然也搞定了所有集團高層……這個就沒怎麼辦了。想想看，年銷售額170億美元的Thermal-Fisher下面一個小小的分公司就能玩弄CNS於股掌之中，不敢想那些銷售額更高的像200多億的Gilead和197億的Amgen之類的公司該玩什麼雜誌。

「根據我們黑到的美國冷凍電鏡商FEI的內部財務規劃」——這完全是經常在中國駐美國各外交使館外路演的某團體的既視感。動不動就是「zhongnanhai內幕」之類的。拜託，就算你有這本事去黑什麼內部財務，黑點技術文檔出來掙錢不簡單快捷多了，還犯得著在這裡匿名懟施一公？這年頭，造個謠也是要智商和技術含量了。

網上鍵盤俠就已經很low了，尼瑪鍵盤俠都不敢用實名，簡直是low的平方。

總結一句: 越是loser越愛嚼舌頭，包括題主列出的台灣論壇，包括那位匿名low。

@mabel 回答的很全面，中肯。膜蛋白結構解析是公認的有難度，但是之前並不是沒做出來過，例如水分子轉運蛋白髮現與解析，得過一屆炸藥獎。顏對GLUT1的技術方法並沒有突破，用了幾十年了。如果她能發現GLUT1作用並作出結構解析，絕對是諾獎級的成就。至於什麼能餓死癌細胞，治療癌症，看CCAV及各不媒體報道的架勢，更是扯遠了，顏寧本人也在科學網上更正了這些不著邊際的誇張報道。靠這成果得諾獎基本不可能，畢竟不是三四十年前了。從個人角度而言，GLUT1也不過為PDB資料庫中上萬蛋白晶體結構又增加了一個成員而己。單純從投入產出率來看，解析蛋白晶體這種工作，對顏本人，清華大學乃至整個中國都是燒錢的黑洞。相反，會便宜了許多國外有著完整研發生產體系的大公司。

補充文章餓死癌細胞：記者錯了，還是顏寧錯了？

對生物學和蛋白質不怎麼懂，但是晶體結構學是看家吃飯的傢伙，簡單點評一下吧。

個人認為晶體結構永遠是一個「後驗」的手段，也即我們要做的是已經有了一個結構，然後去推斷這個結構應該有什麼功能（甚至這一點都很不保險），更多的是有了一個晶體結構，有了這個物質的N多種性質，從結構里去找可能產生這些性質的證據。那麼要是反過來呢？比如有了一個性質一個功能，要反推其結構可不可能？答案是在沒有任何衍射圖譜的情況下，想都不要想。

晶體這個東西很矯情，改變一點兒間距，有時候哪怕0.3-0.5個Angstrom，整個性質跟著全變。而且晶體生長高度受到環境影響。我有一年去開Gordon Conference的Crystal Growth Design分會，有個印度老教授算晶體熱力學的。給我們看了一個圖，一個簡單的不超過20個原子的小分子（是苯甲酸的什麼衍生物來的不太記得），二維圖上畫了幾十個local minimum。也即理論上，這些晶體都是可以獲得的或者說一定程度上穩定存在的，這就是只討論了同一種分子。

所以從這個角度來說，蛋白質結構的解析，儘管蛋白質晶體生長的難度很高，但其本質仍然是晶體結構學。應該說，這個東西更多只能提供一些對該蛋白的功能的認知，要想利用這個結構去設計改造，幾乎是不可能的事情。蛋白整體上鏈的柔性太強，隨便改幾個氨基酸，馬上整條結構都變。

所以其實我也不是很理解為什麼生物學裡結構生物學那麼熱……其實理論上只要學生足夠有耐心足夠細心運氣足夠好，任何疑難蛋白質都是可以被結晶的，只是需要不知道多長時間（十幾二十幾年？……）而且生長一顆晶體的方法，和人的聰明才智能力幾乎沒有任何關係。就是努力，運氣好……

感覺一公和顏寧越來越有危機感了

1一公當年回國，風頭一時無兩。什麼情話大學校長，什麼美國科學院外籍院士，什麼放

棄美國國籍，什麼中央黨校講課。顏寧也是美女教授，普林斯頓椅子教授隨便來去。兩

人發CNS如同探囊取物，基金一拿就是幾千萬上億，到處演講吹牛做青年導師，今天要

攻克老年痴呆明天要根治癌症，彷彿他們就是中國科學的明天。

結果呢，先是一個路都走不動的老太太用毛主席時代的成就拿了諾獎，然後又是一位三

流學校，N年才拿了不到100萬紡錠的老師，帶著一個同樣三流學校畢業的碩士生，把基

因編輯的技術推進一大步。

現在的輿論已經有苗頭開始質疑一公和顏寧花大價錢發了無數篇論文的工作究竟有啥用

處。以前對它們的質疑主要是國外的。現在國內也漸漸出現。一公肯定也感覺到了。所

以才會在去年氣急敗壞地攻擊屠老太太，今年顏寧又開始說韓春雨的研究也不怎麼樣。

這種輿論別看苗頭小，一旦發展起來恐怕就是排山倒海的壓過來。目前很多人還在懷疑

觀望。假如再出現一個類似屠喲喲韓春雨的事，那麼一公肯定就立刻會被拉出來公開批

判了。

Prof. 施一公, aka, Prof. Yee-Kung Shit (一筐.shit)能帶來的, 就是洋大人點的一

堆贊, 和我D的G點還有點距離.

而且prof. 一筐.shit的東西, intellectual mileage太低了, 還是板凳的"來料加工,

兩頭在外"倒貼嫖資妓院經濟型科研. 最終目的不是在於什麼科學發現, 而是跟屁型研

究,麻的羊大人挖個坑, 丫的航次航次的去灌水. 然後求羊大人點個贊, 轉過背就去

要挾我黨, 看, 羊大人說好了, 給我錢, 給很多錢, 給我校長, 部長, 副總理...職務,

otherwise, 你丫的就是老土, 不懂羊大人的規矩, 不會英語, 不會發ＣＮＳ．

從中秧財政直接要來的三億，向美國買了最貴的冷凍電鏡，電鏡商負責做CNS的工作，

批量發表照片。

由三人一組的小分隊組成，三個學生同時提取一個蛋白，誰先提到，誰當第一作者，其

余當並列第一作者。

小分隊之間從來不行互相交流，彼此項目保密，向施彙報。

根據我們黑到的美國冷凍電鏡商FEI的內部財務規劃，FEI把中國市場的份額定位在80%

施一公一個人就買了三台，付了一個億。僱傭大批涉世未深的山區學生，拿到蛋白，就

拍一下，交給CNS發表。施一公對學生內部的要求是，一年20篇 CNS。

FEI 研發新電鏡的研發成本，完全依賴於中國大陸的旺盛的購買力，而CNS對此當然心

神領會，為了美國的國家利益，幾萬億的美元都印了，多印幾張CNS有什麼。

主要是蛋白質三級結構解析，比較重要的一個蛋白質

這事估計離諾獎有點遠，不過施一公的研究離諾獎不遠了，研發的癌症治療藥物已經進入臨床二期，成功就可以投向市場（施一公是THU生命科學院院長）

不是做結構的就別來攪和了，cryoEM這幾年就是這麼火，這麼牛X，僅此而已。