DNA序列是怎麼測量出來的？

01-12

一個很長的脫氧核糖核酸分子，是如何被詳細的讀取出來的？

謝邀。

1. 最原始的方法是Sanger法：

在分子生物學研究中，DNA的序列分析是進一步研究和改造目的基因的基礎。目前用於DNA測序的技術主要有Frederick Sanger發明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain Termination Method）。Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的鹼基處終止，並且在每個鹼基後面進行熒游標記，產生以A、T、C、G 結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然後在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA鹼基序列。

　　利用一種DNA聚合酶來延伸結合在待定序列模板上的引物。直到摻入一種鏈終止核苷酸為止。每一次序列測定由一套四個單獨的反應構成，每個反應含有所有四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)，並混入限量的一種不同的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)。由於ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基團，使延長的寡聚核苷酸選擇性地在G、A、T或C處終止。終止點由反應中相應的雙脫氧而定。每一種dNTPs和ddNTPs的相對濃度可以調整，使反應得到一組長几百至幾千鹼基的鏈終止產物。它們具有共同的起始點，但終止在不同的的核苷酸上，可通過高解析度變性凝膠電泳分離大小不同的片段，凝膠處理後可用X-光膠片放射自顯影或非同位素標記進行檢測。

有時候我們在電視上看到測序的圖片，如這樣的：

便是用sanger法測的。b. 更進一步，就是用毛細管電泳代替跑膠，但原理基本不變

將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發出熒光。由於ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP（4種雙脫氧核糖核苷酸）熒游標記不同，計算機可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是A，T，G，C中的哪一個

其測序結果就是熒光的峰值，像這樣：

把熒光信號轉化為ATCG就是測序結果

2. next generation sequencing

相信大家還記得人類基因組計劃，這計劃從1990年開始到05年基本完成，用的就是sanger測序法。但是這個方法是在是太費時費事，而且消耗巨大的資源。於是各種next generation sequecing方法應勢而生。

具體的方法可以看這篇文章：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1755-0998.2011.03024.x/abstract

如果不是專業了解，看下這個TED的視頻便可以：

這些技術不但更快捷，更便宜，而且更重要的是它是一種更直接和廣泛地研究生物的方法--

Nathan Wolfe在他的研究中利用了測序技術測得在人體鼻子中的所有DNA序列，發現竟然有20%是未知的----他們不屬於人類以及已知的細菌和病毒。

3. third generation sequencing

現在還沒有定論third generation sequencing到底是怎麼樣子，但有興趣的可以看看這篇文章相關介紹http://hmg.oxfordjournals.org/content/19/R2/R227.full

謝邀

雖然隔壁就是測序組，但我其實了解不多。而且我對中文名詞不了解，就隨便說說，期待搞這個的專業人出來講講。

傳統的方法 @葉一說了，我就說新一代，現在正當紅的 nextgen。方法有很多種，本質是強調一個高通路並行處理，就是說同時處理數以億計的序列。

大致步驟是這樣的（手頭沒有更新的圖了）：

J. Shendure and H. Ji. Next-generation dna sequencing. Nat Biotechnol, 26(10):1135–1145, 2008 Oct.

大致過程也是先把 DNA 切成短序列模板，然後把這些短序列都放固定到要成像的 chip 上，每個短序列都是一個 polony，就是說在 chip 佔據一個位置，在這個位置上固定的是一批通過 PCR 複製的這段序列的克隆。

然後就跟傳統方法一樣，配對生長，每長一個核苷酸，就成像一次，在圖像上看就是無數的小點，每個小點對應一個 polony，回頭通過分析就是這個 polony 對應序列的一個核酸（其實具體的技術還很不同，這麼說太粗了）。這樣生長下去，就能把每個 polony 的序列給測出來了。

好處當然是因為高通量，所以一下子就把一個基因組就測了（理論上）。缺點是，每個序列長度都短：長 polony 時，每一步都會因為種種問題，有些序列模板長不下去了，信號也會變弱。最後得到的序列長度相對傳統方法就短一些。

短的問題是，它很難作 de novo 的測序，就是說，因為短序列之間的交疊太少，就無法從短序列合成出全部基因組（事實上，就是傳統的 sanger 法，在染色體末端，因為有大量的重複序列，也是無法很好的測出的，所以人類基因組推出時，這段是沒有的）。所以只能拿舊方法測出的全基因組作參考序列，把短序列對上去（alignment）。這樣，也是越長，對得越准，出現不確定結果的可能越小。

類似的問題是，測序終歸是要看這序列與已知序列的異同，就要面對有很多不同，短序列對很多基因變異的檢測能力會下降，比如染色體的倍增這樣的。

另外的問題是 coverage，就是說用這種高通路方法，生成的以億計的 polony，看上去看多，但可能還是會錯過部分基因組，而在某些部分有很多的短序列覆蓋。早期的方法，好像是能覆蓋 80％，也就叫全基因組測序了。

另外，各種不同測序方法，也有各自的優缺點。

當然，我想經過這幾年發展，技術應該能提高不少。所以，上面意見僅供參考。

我把關於DNA測序的經典方法用中學生能明白的語言告訴你吧!

1. 首先有一段待測的DNA,然後選一個定點作為配對複製的起點.

2. 同時外邊還有很多遊離的核苷酸,可一部分核苷酸是不太一樣的的,意思就是當這個核苷酸參加了一個配對反應,之後就不能再接別的核苷酸加入複製鏈的序列,就是說那些"不太一樣"的核苷酸會成為複製鏈的終點

3. 和原DNA模板配對的反應無時無刻在進行著,所以會有許許多多不同長度的複製鏈產生.他們都擁有相同的起點,可終點的位置不同,因為那些"不太一樣"的核苷酸可以在任意可以插入的位置

4. 不同長度的鏈條就有不同的重量,用膠體電泳方法可以把這些鏈條按照從重到輕(也就是從長到短)來排列

(至於膠體電泳,簡單就是說把一堆DNA鏈條通電,重的跑的慢一些,輕的跑的快一些.然後跑的慢的過了一段固定的時間就會走的距離比較短,跑得快的就走的距離長.這樣一個根據重量也就是鏈條長短排出的圖譜就出來了)

5. 恰好這些"不太一樣"的核苷酸都帶有熒游標記.A/G/C/T都會在激光照射下發出不同顏色的熒光.所以把那一堆排好的DNA鏈條們在激光下照一下,那麼每條鏈末端都會表現出一種顏色.對著一看,就知道每條鏈末端是什麼鹼基

6. 因為DNA數量很大,所以一定可以保證一條鏈和下一條鏈只差一個核苷酸.所以顏色排出的鹼基順序就可以直接推出原DNA片段的序列了!

來說下單分子測序吧，也就是大家說的第三代測序。

現在相對成熟些的是Pacbio的技術，最初的論文發在Science Magazine: Sign In。

總的來說相對於前兩代技術，特點是序列超長，可以達到幾千鹼基對，但是錯誤率要超過10%。

看圖，圖A是基本的實驗設置，在測序儀上有上千個Zero Mode Waveguide(波導，一種傳輸電磁波的結構，具體請參考Waveguide)。在波導里，有一個被固定的Φ29 DNA聚合酶。在測序時，帶有熒游標記的鹼基被DNA合成酶合成到序列上，底部照射的激光打到熒游標記產生熒光信號，記錄儀記錄不同顏色和強度的熒光信號並翻譯成DNA序列。隨後染料結合的熒游標記會被釋放，導致熒光脈衝信號的中止。隨後DNA模板移動到下一個位置，開始準備結合下一個熒游標記的鹼基。

另外一個現在正在開發的技術是利用納米小孔（nanopore）測序（上圖）。基本概念是讓DNA序列穿過納米孔，由於穿過的部位的化學和物理結構不同，所以導致在穿過是導電能力的變化，通過在納米孔兩端施加電壓並測量穿過的電流，就可以推斷出穿過納米孔的鹼基（下圖通過電流的大小來區分ATCG）

相比於Pacbio，nanopore的長度會更長一些，但是錯誤率目前也更高，還沒有完全商業化，只有驗證的產品共實驗室試用。不過Nanopore目前推出的MinION測序儀只有優盤大小，如果真的推出到市場感覺會帶來不少革命

Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules，Science 2 January 2009: Vol. 323 no. 5910 pp. 133-138, DOI: 10.1126/science.1162986
The emergence of nanopores in next-generation sequencing, L J Steinbock and A Radenovic 2015 Nanotechnology26 074003
Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-? precision, Nature Biotechnology 30, 344–348 (2012), doi:10.1038/nbt.2147

前面知友說的都差不多了，我想根據我自己的知識補充一下。

我知道的方法分三種：

1、前面提到過的sanger法，也叫化學合成法，通過對DNA末端進行基於化學合成的逐步擴增，在擴增的時候通過熒游標記來確定擴增的核苷酸是什麼，從而得到DNA序列。

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2、前面也提到過的ngs（next generation sequencing），具體方法上有點不同，不過大同小異，和talich講的差不多，每個公司有自己的一點特色。方法的思想是通過將DNA碎片化，然後批量的擴增，通過信息學手段比對DNA語料庫里的數據，來得到具體的序列。通俗點說就是把一個字剪開，還原成偏旁部首等，然後通過偏旁部首和其他部分在字典里找到一個字。具體到應用在de novo或者是簡單比對上，其實和不同公司的機子還有重複次數等有關，有的原始碎片長一點有的短一點，有的重複多一點有的少一點，有的就准一點有的就便宜一點，各有不同。

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3、還有一種不知道怎麼分類的，也叫single molecular sequencing。將DNA切成相對較長的片段，先熒光染色，然後在電泳的基礎上然後經由nanorods（不記得是不是這個詞了）拉伸，進入nano pore進行序列讀取，文章說是單分子，其實是比較小的DNA分子（貌似是小麥？），在應用到大的分子時還是會切開的，要不然容易在第一部拉伸的時候卡住進不去。這種方法的好處就是讀取的分子長度長，容易區別出重複區，而且速度也挺快的（沒用過，據稱全序列是和454一個級別），不過不知道價格怎麼樣。

沒學過生物也可以自己查文獻吶