分子生物學中RFLP、SNP、PCR、分子雜交、熒光定量PCR，他們的原理和使用方法是什麼？

01-12

謝邀，我看樓上挺全面，就少熒光PCR 了。熒光PCR指的是用特殊的熒光染料染上核酸通過PCR定量。有幾種染料，比較精確的taqman是核酸探針，根據不同的目的基因進行設計再進行PCR反應。比較便宜通用的是sybr green，通過摻入核酸鏈之間來顯色，通過PCR過程中檢測熒光量來定量。

剛好沒事回答一下，若有不足，歡迎指正加補充

原理：

RFLP（restriction fragment length polymorphism）：

DNA提取→用限制性內切酶酶切DNA→用凝膠電泳分開DNA片段→把DNA片段轉移到濾膜上→利用放射性標記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）和結果分析。

在同源的染色體區段的DNA，用限制性內切酶切割，會產生不同的區段，之後用標記好的探針進行雜交，得到的圖譜可以顯示出各個區段的差異性。

SNP(single nucleotide polymorphism):

是在基因組的水平上由單個核苷酸引起的DNA序列的多態性，SNP的位點在基因組中廣泛存在，人類的基因組中一般500-1000個鹼基會存在一個SNP位點。

通俗的說：就是染色體某段基因--DNA雙鏈中，A,T,G,C哪個鹼基不配對了

PCR（Polymerase Chain Reaction）

以上就是PCR的原理圖，主要就是以DNA 為模板，在序列的保守區域設計引物5『和3』，加上一些作料（PCR所用的材料--聚合酶，引物，dntp，buffer ect）檢測是否存在我們所需要的目的片段

分子雜交（molecularhybridization）確定單鏈核酸鹼基序列的技術。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過鹼基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。

下班了~~~先到這

樓上們挺全，我撿漏說句熒光定量原理

熒光定量PCR通過檢測每個PCR循環後雙鏈DNA的量/增量並與標準曲線比對，從而得出目標片段的起始量（其實等同於每個循環後跑一遍膠看亮度）。SybrGreen EvaGreen之類的染劑是熒光劑-粹滅劑原理（evagreen是兩個熒光劑連一起互為粹滅劑），遊離時無熒光，嵌入雙鏈DNA後熒光劑和粹滅劑離的遠了產生熒光。這種反應要求靈敏度高噪音小，所以跑膠用的那些染劑（EB啊sybr safe啊gel red啊什麼的）不適用。另外用evagreen的時候務必加reference dye，不然濃度低時跑出來的曲線跟天女散花似的，別問我怎麼知道的。還有一種常用的探針是TaqMan，原理是在被檢測位點上雜交一段DNA探針，兩邊分別帶熒光劑和粹滅劑，在子鏈DNA聚合時探針會被頂走，頂走後探針發熒光。這個靈敏度特別高，相應的探針也不便宜。

至於標準曲線，有時候根據檢測需求不同其實並不需要。如果要檢測一個樣本中目標片段的絕對濃度，那麼標準曲線是一點要的。不過有時候我檢測子代老鼠某基因是純合還是雜合，就只需要陰性和兩個陽性（純合/雜合）做對照就行了，有時候沒有已知的雜合對照就陰性和純合也行，雜合的Ct會比純合多一倍。至關重要的一點：樣本一定要normalize濃度。別問我怎麼知道的。

說到染劑，跑普通PCR的瓊脂膠時別用gel red，片段長度越小越慘，條帶跟瓷器的蚯蚓走泥紋似的。具體原因沒確定，然而我懷疑是因為gel red的結構是把兩個ethidium連在一起，兩個ethidium分別插入DNA不同位置，於是把DNA拽彎了，導致有的地方跑的快有的地方跑的慢。不差錢用sybr safe，差錢用EB吧。染劑最好煮完膠後放稍微涼一點（60C上下，用手能拿住瓶子）再加，不然EB揮發很可怕，gel red和sybr safe會一定程度降解。跑完膠泡EB水我個人絕對不做，條帶邊緣會毛茸茸的不說，EB揮發我是拒絕的。如果膠里加EB的話時間跑的時間別太長，EB會往陰極跑，跑時間太久了EB都去緩衝液里了。別問我怎麼知道的。