利用16S測序等方法分析菌群丰度之後，如何進行驗證？

對腸道菌群或環境菌群，通過16S rDNA測序或宏基因組等方法進行分析，鑒定到特定差異菌之後，如何進行驗證？尤其是在多數菌為難以培養的厭氧菌，拿到該菌基因組DNA也很困難的情況下？

怎麼驗證呢？其實很簡單，你就假設這個世界上沒有「高通量測序」這麼一項技術，這種情況下你會怎麼設計實驗去解決你面前的這個科學問題？想清楚了以後按照那個設計做一遍就行了。

統計顯示有差異的要驗證，為了排除假陽性，嗯，好。那統計檢驗顯示沒有差異的為什麼不驗證？假陰性就不管了？

要麼你不相信組學和統計學，要麼就尊重組學和統計學得出的結果。

高通量技術和低通量技術不是前者給後者當過濾器、墊腳石的關係。先用高通量方法搞一組候選然後用低通量方法逐個驗證，這讓人有一種早期三代戰鬥機上拿機械儀錶給數字儀錶當備份的既視感……

擔心高通量方法的準確性不夠就好好改進高通量方法和統計演算法，使得得出的結論更準確可靠。別總想著fallback到舊方法。

差異物種的識別本質上來說是從兩個不同的總體中抽樣，對樣本進行某種差異檢驗來判斷是否能以較高概率保證兩個總體存在差異。

即便研究的對象不是厭氧細菌，這個問題也是如此。驗證的方法基本上有兩種。

一、從結果出發，分析相應差異物種的代謝、功能，發現這個物種對環境影響的內在規律，進而從量化規律出發計算兩總體的精確分布。

二、進行獨立驗證。

Microbiome biomarkers of a given condition are often strongly study dependent. It is thus crucial to validate biomarkers across technologies and cohorts to enhance reproducibility and minimize batch effects.

——Shotgun metagenomics, from sampling to analysis

出於嚴謹的目的，大部分discovery只會在極高的置信水平下得出，但是仍然很難排除實驗操作、分析方法等差異帶來的batch effect，因而獨立驗證是有價值的。

能夠找到差異菌的特別標誌物，通過標準物進行驗證