如何判定熒光定量結果的真實性？

01-12

我是南農的一名小博，一直在用promega的熒光定量試劑做熒光定量實驗。自認為對熒光定量實驗有充分的了解，實驗操作也很嫻熟，但是最近的實驗讓我對自己產生了很大的懷疑。

如果你說的是熒光定量PCR的話：

根據最終得到的數據不同，定量PCR可以分為相對定量和絕對定量兩種。

典型的相對定量如比較經過不同方式處理的兩個樣本中基因表達水平的高低變化，得到的結果是百分比；絕對定量則需要使用標準曲線確定樣本中基因的拷貝數或濃度。

根據所使用的技術不同，熒光定量PCR又可以分為TaqMan探針和SYBR Green I 熒光染料兩種方法。比較而言，探針雜交技術在原理上更為嚴格，所得數據更為精確；熒光染料技術則成本更為低廉，實驗設計更為簡便。

在選擇實驗方案時要根據實驗目的和對數據精度的要求來決定。

定量實驗與定性實驗最大的不同，是要考慮統計學要求並對數據進行嚴格的校正，以消除偶然誤差。因此重複實驗和設立內對照非常重要。由於各種各樣的客觀原因，這一點在實踐中往往被輕視或忽視，需要著重強調。當然，與定性實驗一樣，定量PCR也要設立陰性和陽性對照，以監控試劑和實驗操作方面可能出現的問題。

1.終點定量不準確

理論上PCR是一個指數增長的過程，但是實際的PCR擴增曲線並不是標準的指數曲線，而是

S形曲線。這是因為隨著PCR循環的增多，擴增規模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA

模板等各種PCR要素逐漸不敷需求，PCR的效率越來越低，產物增長的速度就逐漸減緩。當所有的

Taq酶都被飽和以後，PCR就進入了平台期。由於各種環境因素的複雜相互作用，不同的PCR

反應體系進入平台期的時機和平台期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是重複實驗，各種條件基本一致，最後得到的DNA拷貝數也是完全不一樣的，波動很大【1】。

傳統的定量方法，如溴乙錠染色或放射性核素摻入標記後的光密度掃描等，測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。由於PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關係，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。

對於絕大多數實驗，比如甲肝的診斷、藥物療效的監測等，需要測定的都是PCR放大之前標本中的DNA原始拷貝數，經過PCR擴增以後的DNA拷貝數已經不能反映真實情況。在這種情況下，就不能採用終點定量，而要根據CT值確定DNA起始拷貝的數量。

2. CT值與起始模板拷貝數成線性關係

CT值的定義是PCR擴增過程中，熒光信號開始由本底進入指數增長階段的拐點所對應的循環次數。重複實驗中可以直觀地看到，儘管平台期DNA拷貝數波動很大，CT值卻是相對固定的。如果用不同濃度的DNA作PCR，可以看出DNA濃度越高，CT值越小。DNA濃度每增加1倍，CT值減小1個循環。CT值與模板DNA的起始拷貝數成反比.

其數學證明為：

$R_{n} =R_{B} +x_{0} imes Rs imes (1+Ex)^{n}$

既第n次PCR循環時的熒光信號強度(Rn)等於背景信號強度(RB) 加上每個分子的熒光強度(即單位熒光強度，RS) 與分子數目的乘積，， $x_{0}$ 是初始目標分子數， $E_{x}$ 是目標分子擴增效率, $n$ 是循環數， $C_{T}$ 代表目標擴增產物達到設定閾值所經歷的循環數。

當循環次數 $n=C_{T}$ 時, $R_{T} =R_{B} +x_{0} imes (1+Ex)^{ C_{T}} imes Rs$

兩邊取對數，得 $log(R_{T} -R_{B})=logx_{0} +C_{T} imes log(1+Ex)+logRs$ ;

整理得： $C_{T} =- frac{logx_{0} }{log(1+E_{x} )} +frac{log(R_{T} -R_{B} )-log(R_{s} )}{log(1+E_{x}) }$

由上可得，對於每一個特定的PCR反應來說， $E_{x}$ 、 $R_{T}$ 、 $R_{B}$ 和 $R_{s}$ 都是常數，所以 $C_{T}$ 值與 $logx_{0}$ 成反比，也就是說， $C_{T}$ 值與起始模板拷貝數( $x_{0}$ )的對數成反比。

3.數據分析的幾個概念【2】：

基線（Baseline）:擴增曲線中的水平部分；

調整原則：如果CT值&>18，不需調整，使用自動分析結果；如果CT&<18，修改終點，再分析一次；起點一般取3-6，終點一般取12-15.

閾值線（Threshhold）：熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的預設設置是 3-15 個循環的熒光信號的標準偏差的 10 倍。

手動調節閾值線的原則：要大於樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數期的最初階段，真正的信號是熒光信號超過域值.

4.數據分析三部曲

①曲線分析（Amplification Plot）：

該步驟主要是對擴增曲線進行整體或單個的調整，主要包括：對數曲線與線性曲線的轉換、模板或內標檢測探針的選擇、基線的調整、閾值的設定等幾個方面。

主要有整體曲線的觀察：分析是否存在污染（主要是試劑污染）；分析是否有因物理或其他因素造成的異常曲線情況；

陰性對照分析：觀察是否存在污染；

陽性對照分析：觀察是否在質控範圍內；

標準品分析：觀察標準品分布是否均勻，梯度是否正常，Ct值是否正常。

②標準曲線分析（Standard Curve）

該面板主要用於標準曲線參數的分析，通過對曲線各個參數的統計，可以判斷實驗定量的準確程度或者試劑的穩定程度。其主要包括三個參數：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（線性相關性）。

上圖為外標定量方法原理圖。

模板DNA量越多，熒光達到域值的循環數越少，即Ct值越小。

標準品與待測樣本的擴增效率一致。 Log(濃度)與循環數呈線性關係，通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，根據樣品Ct值，就可以計算出樣品中的起始模板量。

Slope（斜率）：理論值為-3.32。可以從兩個方面來分析，首先是標準曲線的10倍梯度關係，如果梯度正確，斜率數值會比較接近理論值；其次是試劑的擴增效率，當梯度正確的情況下，擴增效率越高越接近理論值。

Intercept（截距）：不同公司的試劑截距有很大的不同，主要是指只有1個病毒擴增時，曲線出現的Ct值。

R2（線性相關性）：指示本次實驗標準品的線性關係。

註：優質試劑的標準品每次實驗的參數是比較穩定的，做質控分析後偏差應在±2SD範圍內，Ct值變異係數應小於10%。

③定值濃度或Ct值：

通過上述步驟分析後，可以得到一個比較準確的定量結果或Ct值，如果在上述步驟中沒有記錄到異常曲線或者情況，則可以發出正確的報告，對於異常的曲線或者情況，則需單獨分析，確定重複實驗的必要性。

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參考文獻

【1】《實時熒光定量PCR原理和實驗》，陳雲地，美國應用生物系統公司；
【2】《實時熒光定量PCR簡介、結果分析及報告》，周向陽，廣西臨床檢驗中心；

侵刪。

如果你說的是Luciferase assay

熒光會隨時間衰減。(時間一致)

熒光會隨溫度變化。(溫度一致)

熒光會被某些雜質影響。(沖洗細胞、取用試劑時規範操作)

熒光底物凍融會顯著降低熒光活性(凍存前分裝)

熒光有一定的誤差範圍，需要多次取重複。

看了皮蛋他哥發的廣告才意識到似乎說的是RT-PCR，請答主確認一下是哪個。

RT-PCR主要的影響因素

一個是RNA降解，可以通過跑電泳觀察rRNA條帶銳利度和比例看出來。

第二是引物的擴增效率。如果擴增效率低於80%或高於100%，得出的結果往往是不可信的。這可以通過比較幾對引物的擴增曲線、查閱資料庫中細胞、組織的一般表達數據來得出粗略的衡量。還有就是做標準樣調查斜率和線性也可以一定程度上表徵。現在有些雜誌會要求擴增數據，比如我發的一篇就附上了PLOS ONE: p53 Represses the Oncogenic Sno-MiR-28 Derived from a SnoRNA (S1_Fig) Plos One本身不要求，但我原來是想投更高的雜誌的。後來被一個審稿人針對不斷打壓才降到了Plos One。

第三是內參。內參是經常被忽視的因素。實際上細胞中沒有哪個RNA是真的永久不變的，18s rRNA和U6， GAPDH，ACTB，PSMB4等RNA表達都會變，而且在不同的細胞/組織，不同的處理條件下變化還不一樣。在我做的兩個課題中，雖然細胞系同樣是MCF10A，p53模型里PSMB4最穩定，但是另外一個miRNA模型里PSMB4被調控幅度達到50%以上。

必須對每一個模型分別進行內參的評估。評估可以互相比對、比對總RNA，以及比對deep-seq和microarray

realtime么？個人經驗就是多跑幾個內參，內參和目的基因的CT最好不要差的太多，差太多算deltaCT會有很大的誤差

為毛感覺這個問題應該在某生命科學類的技術論壇，而不是出現在我大知乎？

我說下我之前的一些經歷，我一直在用諾唯贊生物（vazyme）的熒光定量試劑做熒光定量實驗。

vazyme的試劑為了防止反覆凍融對酶活性造成影響，所以試劑比較粘稠，實驗之前要反覆顛倒混勻。這我才想起來，我當時是拿了試劑也沒細看說明書，就直接抽吸了。針對我的實驗問題，vazyme的張博士（也就是熒光定量試劑的研發總監）還親自跟我聯繫，並給我提供了鑒定熒光定量結果的真實性的方法。根據張博士的建議，我進一步對vazyme和promega的試劑進行了對比試驗。結果證明自己之前認為完美的數據，竟然都是假的，我居然一直被表面的CT值欺瞞了這麼久。不過幸好發現的早，不然就難逃延期的厄運了。現在將自己的實驗分享給一起奮戰的戰友們，不要再犯同樣的錯誤。實驗不易，且做且珍惜啊。我把自己的實驗的具體結果奉上：

　　圖一 promega(上圖)和vazyme(下圖)試劑在相同cDNA和相同程序下產生的標準曲線圖

　　由圖中可以看出promega和vazyme試劑標準曲線的相關性幾乎一樣，但是promega的擴增效率僅僅只有一個大於0.9，而vazyme試劑的擴增效率均在0.9以上。說明vazyme的試劑擴增效率更高。眾所周知只有在擴增效率大於0.9的條件下，才可以粗略使用2-ΔΔct進行數據分析。

　　圖二 promega(上圖)和vazyme(下圖)試劑在相同cDNA和相同程序下產生的溶解曲線圖

　　從圖中可以看出，promega(上圖)比vazyme(下圖)試劑得到的溶解曲線峰值高，但是vazyme試劑得到的溶解曲線在主峰之前沒有小峰，說明vazyme試劑的擴增特異性更好。

　　之前的我只是一味的通過ct值的大小和溶解曲線的峰值來判定試劑的好壞。現在終於明白標準曲線才是判定定量體系和定量結果有效性的王道。只有通過標準曲線才能判定所獲得ct值是否有意義，計算的結果是否真實。

每一次都帶內參基因一起跑cycle，重複孔一定要。然後樣本要來自三次以上重複實驗