如何看待 2017 諾貝爾化學獎冷凍電鏡 (Cryo-EM) 技術？該技術有哪些突破？
冷凍電鏡技術已獲得 2017 年諾貝爾化學獎。本題已加入知乎圓桌 ? 2017 諾貝爾獎巡禮，更多「諾貝爾獎」相關話題討論歡迎關注。
謝邀。老闆開會去了，再加上11月11號全校放假，抽出時間回答下。
說老實話，知乎上更有資格回答這個問題的應該是師兄張皛閌 還有中科院生物物理所的前輩Lewind
。我正好這學期帶這門課的實驗，就把教本科生的那套寫一下吧。
雲昏無復影，冰合不聞湍：冷凍固定術
冰封一向是有效的保存手段，古今中外，概莫能外：曹操築銅雀三台之冰井台，設計以儲存冰塊食物等；傳媒大亨默多克冷凍精子，使隨後降生的女兒獲得數億資產繼承權；就連賽柏坦星人威震天都在冰里呆了9000多年。水結冰後會阻礙原先在溶液狀態下快速的物質交換與擴散，低溫使得化學過程速率降低：絕大多數代謝過程變得非常非常慢以至於我們難以察覺，這個技術叫做冷凍固定術(Cryo-fixation)。應用冷凍固定術，在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，就叫做冷凍電鏡（CryoEM）。冷凍電鏡是重要的結構生物學研究方法，與之地位相當的另兩種技術是X射線晶體學(X-ray
crystallography)和核磁共振（NMR），這些方法都是為了獲得生物大分子的結構以了解其功能。冷凍電鏡，就是把樣品凍起來然後保持低溫放進顯微鏡裡面，高度相干的電子作為光源從上面照下來，透過樣品和附近的冰層，受到散射。我們再利用探測器和透鏡系統把散射信號成像記錄下來，最後進行信號處理，得到樣品的結構。聽起來很簡單？在過去的一年半的時間裡，冷凍電鏡技術完成了自上世紀70年代以來最大的技術飛躍，很多結構生物學組集體轉向冷凍電鏡，不再吭哧吭哧的結晶了。就在上周，Nature上線了幾乎是諾獎級別的冷凍斷層成像論文，按照老闆的話說：「任何放進顯微鏡的東西都成了金子，我這輩子從來都沒有見過這樣的景象。冷凍電鏡的黃金時代真的來臨了。」
圖一：冷凍電鏡工作原理，得到的照片信噪比較低
松迥月光先照鶴，寺寒溝水忽生冰：快速玻璃化
有些人可能讀過雪中僵卧不須悲：液氮中的來生 - 隨手乾貨解救戰火知乎 - 知乎專欄
是關於如何冷凍生物並且使之不變性的。簡單的把樣品凍起來只會讓它在水結冰的過程中變形扭曲：凍過的肉味道可不怎麼樣。我們需要讓水結成固體，但不是晶體的冰。在變成固體的過程中不能有大的形變。這種條件非常苛刻:誰能凍一罐未開封的可樂，易拉罐最後還不形變的？大實驗室都採用冷凍機器人，能夠控制點樣時的濕度和溫度，保證用特製濾紙擦過樣品之後，殘留的部分保持恆定，不會太厚也不會幹掉，然後在封閉環境中以高速扎進用液氮冷卻的液態乙烷中。這種方式的冷卻速度如此之快，使得水分子還來不及轉向就被固定在了原處，在數毫秒之內就完全凍好了。以這種方式製得的冰不是晶體，而是無定形態，在電鏡下是透明的：玻璃也處於無定形態，玻璃化的名稱由此而來。樣品就鑲嵌在無定形冰中，定在真實的一瞬。
圖二：GroEL鑲嵌在冰中
洛陽親友如相問，一片冰心在玉壺：高性能顯微鏡
材料齊了，有個金剛鑽是十分重要的。你知道一台最好的可以做冷凍電鏡的透射電子顯微鏡需要多少錢嗎？現在得450萬美元。你還別嫌貴，這還只包括顯微鏡，不含什麼電子探測器啦，球差矯正器啦，能量過濾器啦，相位板啦……全加起來保守估計600萬美元，另加上每年數十萬美元的儀器維護費:只有真的土豪才能負擔的起。我們有全球第二台，中科院生物物理所有一台，清華有三台……土豪我們做朋友。顯微鏡貴，體現在以下幾處優點：第一是加速電壓高，電子能穿透厚樣品。加速電壓高導致顯微鏡巨大，我們必須挖開天花板，並且在地下最底層往下挖才勉強把它放進去。第二是透鏡多，各種矯正，光線各種平行，球差各種小，相干度各種好。第三就是樣品台穩定，其他組的破鏡子每照一張之前需要10分鐘穩定樣品台（就是乾等著），最好的20秒就足夠，效率至少是30倍。第四就是全自動，自動換液氮，自動換樣品，自動維持清潔，我在家裡就能把磚搬了。聽說最近國內一些地方準備花大價錢買，世界各處也在招人，希望等我畢業的時候還有些坑留著。
圖三，房頂得被挖開。
心同野鶴與塵遠，詩似冰壺見底清：高效率探測器
終於要到正題了，為什麼過去一年半會有如此大的進展了：關鍵在於顯微鏡底部的電子探測器。目前常用的高級電子顯微鏡是300kV加速電壓的，在300keV的電子的轟擊下，大部分器件都會被打爛。在最新一代的電子探測器出現之前，我們使用電荷耦合器件（CCD），就是電子照下來要先打在熒光層上變成光信號，然後CCD再把光信號轉成電信號生成圖像。多餘的一次光轉換降低了效率。在冷凍電鏡中，樣品對電子劑量非常敏感，同一個地方看的時間長了就會被電子打爆，所以每個電子都非常的珍貴。最新的技術能夠直接把電子抓下來，並且利用和超分辨熒光顯微鏡類似的技術來數電子，甚至可以對單個電子進行局部定位，把對比度提到了只在夢裡才能想見的地步。因為這個探測器，許多以前不起作用的演算法都能用了，看不見的蛋白質可以找到了，不用再一張一張的掃底片了。想買新的直接電子探測器？準備好100萬美元，然後砍砍價。雖說是電子產品，但我覺得摩爾定律在這裡不適用。
間關鶯語花底滑，幽咽泉流冰下難：漂移矯正
一般來說，在拍攝某一樣品的過程中，我們假設樣品是不會自己動的:你拿相機拍運動的東西，曝光時間一長就會糊掉。冷凍電鏡也有這個問題：電子束嘩嘩的穿過樣品，這些無定形冰就會變軟，變形，帶著樣品移動。因為無定形冰不是晶體，所以在外部強能流的影響下就會展現出些水的性質：這種流動雖然慢，卻在電子顯微鏡下被萬倍的放大，成為限制數據質量的大問題。有了高效探測器，我們可以把之前的1次曝光分解成30多次並且保證總電子量不變，由拍照片變成了拍電影，再把這些電影合併成一張近乎於完美的照片。就這樣，冷凍電鏡的拍攝技術達到了前所未有的高度。
圖四：組裡很久之前的結構，病毒相對好做。目前一般的蛋白，甚至是膜蛋白都能做到類似的程度。
這種技術有多瘋狂？老闆經常拿他的朋友Yifan舉例，2013年一年可以發4篇nature正刊，一篇nature
method，一篇cell，手下博士後直接去Harvard開始tenure
track，北大生命科學院前院長饒教授發博文說是諾貝爾獎級別的工作。我們自己組裡也有Cell,
Nature, Science，大多是投了就中，很少被拒。實驗室幾個師兄開心的找教職，各大製藥公司各種招會冷凍電鏡的來測試新葯可靠性，工作一點兒問題都沒。
不要黑生科，我們是學物理和信號處理的。
直接回答技術突破吧：1。直接電子探測器。和CCD相比基本就是單反和卡片機的區別。
2。隨之而來的演算法。高速的記錄能力使得之前只能記錄一張照片，現在能記錄幾十幀的影片。這麼說吧，以前是在用美圖秀秀，現在在用繪聲繪影。
結果，是解析度的大規模提升。以前只能看清楚個人影，現在能看清楚臉上的雀斑。電鏡裡面原子解析度最早的突破來自二維晶，不過那東西太難長，所以幾十年了沒太大的發展。最近的解析度突破最先來早Z.H. Zhou,相近時間還有2個組也到了3點個埃。現在的火熱則來自DDD（Direct Detector Device, CMOS camera), 把motion-correction, sinlge-electron counting, better DQE等等都實現了。Titian Krios在07、08左右就有了，是儀器上的大突破，不過一直等著camera這塊短板的補齊。演算法上Maximum-likelihood也有比較大的貢獻，當然之前其他組不用ML也能達到或接近原子解析度。總而言之，最近是萬事俱備了！冷凍電鏡的好處是樣品要求低，水化環境，無須結晶，能處理動態結構。當然，儀器仍然很貴很貴！
自從有了一直就很火啊。。。不需要啥突破，從一開始就很牛逼了。
傳統EM又脫水又真空，而你看這個可以不脫水不破壞蛋白質結構進行EM，多好。
拍幾張照片就可以統計3D建模，簡直是結構生物學的地圖炮，學術灌水的消防栓啊。有興趣可以讀讀下面這篇review。
Cryo-electron microscopy
我在哥倫比亞大學中國學生學者聯誼會負責媒體，這個是我們團隊最近製作的一期關於冷凍電鏡的科普文章，謝謝團隊中每個人的努力。若有科學性問題歡迎指正，勿噴。轉發請聯繫哥倫比亞大學中國學生學者聯誼會微信號 Columbia_CSSA。
【哥大故事】 大家好，給大家介紹一下，這是我們哥大的諾貝爾獎！
2017-10-12 哥大故事欄目組 哥倫比亞大學中國學生學者聯誼會
最近哥大搞了個大新聞！2017年諾貝爾化學獎授予了三位科學家，以獎勵他們在「冷凍電鏡」（cryo-electron microscopy）領域做的傑出貢獻。哥大教授Joachim Frank就是其中一位！（本文中我們就叫他弗蘭克爺爺吧。）
好嗨森！為哥大的科學家瘋狂打Call！那麼問題來了，作為哥大學子，總得搞清楚這個神奇寶貝才能出去介紹一番，科普的重任就交給每一個哥大人啦！
那麼我們今天就來聊一聊這個諾獎成果：冷凍電鏡
首先，這個寶貝是幹嘛用的？
簡單地說，就是給生物大分子拍高清照片，以得到它們的三維結構。
你也許會問，幹嘛要得到分子的三維結構呢？其實之後的可能性就很多了，例如分子的三維結構可以幫助科學家們理解生化反應機制，對於分子藥物設計也有重要意義。最近幾年結構生物學很多突破性的進展，都是靠得到生物大分子的高清無碼照之後產生的。
好吧，那怎麼給生物分子拍照這麼難呢？
首先大家在中學生物課用過的光學顯微鏡肯定是不夠了。要看清楚分子級別的結構，必須用電子顯微鏡，也就是用電子束代替光線去成像。理論上電子劑量越高，成像質量越好。然而生物分子太脆弱，無法承受高劑量電子的衝擊。如果把生物分子比作螞蟻的話，高劑量電子對於生物分子的破壞就相當於一顆原子彈在螞蟻身上爆炸的威力。
於是有人（也就是本次諾獎的另一位得主亨德森爺爺（Richard Henderson））提出用低劑量的電子束配合疊加平均的辦法解析生物分子結構，並取得了成功！圖像解析度達到了0.7納米，相當於頭髮絲的十萬分之一！然而，他要求分子在樣品中整齊排列，這個方法普適性比較有限——因為有些分子很難進行排列，強行排列以後又會有畸變失真。
接下來輪到本文主角哥大教授弗蘭克爺爺閃亮出場！他發現，通過給成千上萬個隨機朝向的同一種生物分子照相，得到不同角度的二維圖像後再運用計算機軟體進行三維重建，就可以得到分子的完整三維結構。
此外，另一位諾獎爺爺杜波謝（Jacques Dubochet）提出了 「速凍」技術，它使生物分子能夠快速冷凍在玻璃態的水中（注意啦，玻璃態的冰可不是一般的晶體冰哦，「速凍」過程中它的體積不會發生變化，從而不壓壞分子），然後再在電鏡底下觀察，進一步保護了分子不受電子破壞。結合弗蘭克爺爺的後期分析方法，這條路走通了！
至此，科學家們提出了完整的「冷凍電鏡」的方法，簡單地說就是「冷凍分子樣品——電鏡二維成像——軟體三維重構」。到最近幾年，「冷凍電鏡」已經能夠達到0.18納米的解析度，科學家們終於能夠愉快地分析生物大分子的結構啦！撒花！
Joachim Frank教授簡介
Joachim Frank教授早在1960年代後期便開始探索如何使用電子顯微成像和數字圖像分析方法來解析出生物大分子的三維結構。隨後沿著這一方向，他先後在美國的加州理工大學噴氣推進實驗室，加州伯克利大學唐納實驗室和康奈爾大學應用物理系從事博士後研究。後來他到德國的馬克斯普朗克研究所做訪問學者，兩年後到英國劍橋大學的卡文迪什實驗室做高級研究員助理，1975年加入在美國紐約的Wadsworth Center，1998年當選為霍華德·休斯醫學研究所教授，2003 年生物化學與分子生物物理系客座教授，2008年正式加入哥倫比亞大學生物化學與分子生物物理系和生物系共同任教。他在2007年當選為美國科學院院士。他的整個職業生涯就是開創與完善分子電鏡成像理論和方法，並把這一方法應用於觀察核糖體結構從而來研究蛋白質合成機制。
Joachim Frank教授培養的部分中國學者
朱軍，1992-1996博士生，現任紐約西奈山醫學院遺傳和基因組學的終身教授。
雷建林，2000-2009博士後，現為清華大學生命科學學院研究員，國家蛋白質科學研究（北京）設施清華大學冷凍電鏡平台總管。
高寧，2002-2006年博士生，2006-2008年博士後，2008年完成學業之後回到中國清華大學參與搭建冷凍電鏡的研究平台。現任北京大學生命科學學院教授。
沈冰心, 2011-2017博士後，現任賓州Temple University計算機系的助理教授。
陳博，2008-2014博士生，2014-2015年博士後。現任投資銀行Evercore ISI生物醫藥行業研究助理。
傅潔，2003-2009博士生， 2009-2011 博士後。後進入量化投資領域，現任量化基金Jefferies Strategic Investments研究員。
李文，2003-今，研究員。
柳正，2013-今，博士後研究員。
張靖佶，2016-今，博士後研究員。
孫銘 ，2011—2016博士生。現為加州大學舊金山分校博士後研究員。
名單未完待續~希望老爺爺健康長壽，培養更多中國學生~
專欄顧問：傅子敖，Frank教授的博士生
漫畫作者：鍾碧瑩
文案編輯：陳天健，周佳琪
原文鏈接：【哥大故事】 大家好，給大家介紹一下，這是我們哥大的諾貝爾獎！
最重要的革命性事件大約發生在2013年前後：
一個是直接電子探測器的發明，
另一個是高解析度圖像處理演算法的改進。
完了。
談到這個，要從TRPV1膜蛋白（一種在疼痛與熱知覺中起中心作用的蛋白質）說起。冷凍電鏡之前，結構生物學研究主要依賴X射線晶體學和核磁共振技術，因為冷凍電鏡解析度不夠研究小分子量得蛋白質。而顯微鏡底部電子探測器技術的突破改變了這一現狀。2013年12月5日華人學者程亦凡與David Julius利用冷凍電鏡以近原子解析度3.4埃確定了TRPV1的結構，而之前X射線晶體學方法很難對膜蛋白進行解析。這樣就促使許多從事X射線晶體學研究的結構生物學專家和許多製藥公司關注這一技術。外部原因，冷凍電鏡屬於上世紀70年代歐美國家已經應用的技術，中國在90年代才開始研究，而最近幾年伴隨一批優秀的科學家學成歸國，在加上政府科研投入的增加使我們與國際先進水平差距縮小
可以參考這些科普文章：
能否全面介紹2017年諾貝爾化學獎，冷凍電鏡cryo-EM？
什麼是2015年最受科學界關注的新技術？
冷凍電鏡（cryo-EM）頂級泰斗理查德·亨德森Richard Henderson | 人物
呃，一直都火，最近火主要是因為直接感應單電子的camera被製造和開發為高解析度蛋白結構提供了可能（據說程亦凡等幾個組在這個相機上市之前就盯上預定並測試了，真是夠tm賊的），以及程亦凡的實驗室因為這個camera把trp channel的高解析度結構解了出來。這傢伙，牛逼啊。所以說人活著，要等機會啊，不要過早等死。做20年博後算什麼！
http://m.instrument.com.cn/news/d-139239.html這篇對程亦凡教授的訪談介紹了冷凍電鏡的技術發展情況，我覺得可以參考一下。
用物理的手段解決了生物問題，得了化學獎。
可惜冷凍電鏡是美國FEI公司的，技術突破仍然來自美國。也就是說我們仍然是在買高通的晶元做小米手機，相對來說是了不起的，但還是沒有太大驚喜，大家頭腦清醒一點！至於諾貝爾獎，菩薩保佑吧！
不知道你說的是看負染，冷凍電鏡的還是看細胞的
看負染和冷凍電鏡那個解析度近幾年有極大的提高 甚至有超越晶體衍射的可能 主要是因為設備上大陣列直接電子ccd的使用跑個題，感覺cryoEM技術準確來講是不是應該頒「諾貝爾理綜獎」。用物理技術解決生物化學方面的問題。。。
Joachim Frank
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