CRISPR/Cas9 系統目前的研究熱點有哪些方面？

01-06

看到這個最近挺火的，所以想問下有沒有人可以介紹一下

普及的話，相關的知識很多，希望大家可以提出，我再來補充。

以下是基本的相關知識^_^

1.什麼是CRISPR/Cas9？

CRISPR----Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 是在細菌和古細菌中廣泛存在的成簇的、有規律的、間隔的短迴文重複序列。07年，發現細菌可以用CRISPR系統抵抗噬菌體的入侵；08年，發現細菌的CRISPR系統能夠阻止外源質粒的轉移。是細菌的一種獲得性免疫系統。

Cas----CRISPR-associated

CRISPR/Cas9----CRIPSR-Cas系統分為Type I、TypeII 、Type III三種類型。在TypeII 系統中包含一個標誌性的Cas9蛋白（參與crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌體DNA或外源質粒)。CRISPR/Cas系統和Cas9蛋白結合成複合體，發揮識別和降解入侵的外源DNA功能。

2.CRISPR/Cas9的優缺點

優點：

構建方便簡單快捷
高效的介導基因定點敲入和基因組的點突變
精確的切口酶活性提高了基因治療的安全性

缺點：

嚴重的脫靶性

3.CRISPR/Cas9的用途

CRISPR/Cas9被改造成第三代人工核酸內切酶（前兩代分別是ZFN和TALEN），用於複雜基因組的編輯，目前該技術應用於人類細胞、斑馬魚、小鼠及細菌的基因組精確修飾。

4.CRISPR/Cas9目前熱點

CRISPR/Cas9有個極大的優勢就是可以改造為切口酶，在DNA的特定位置製造單鏈切口，這樣不會引起非同源末端連接，但是可以激活同源細胞的重組。

這套系統目前的主要用途是在以下幾個方面：

基因定點InDel突變
基因定點敲入
兩位點同時突變
小片段的缺失
編碼基因和非編碼基因（lncRNA、microRNA）的靶向基因敲除

此套系統的風靡應該是在2012年，將此系統應用於基因治療，對人類的遺傳病、腫瘤、癌症的治療有所貢獻。

CRISPR/Cas9的切割是通過gRNA與基因組位置之間20bp鹼基的配對，且配對鹼基的5′端需要有PAM結構(NGG)，再引導Cas9作用實現的，目前的由於脫靶效應使其應用有所限制。

最後，奉上用CRISPR/Cas9系統敲出特定基因後培養的斑馬魚萌照一張 ^_^

本人從CRISPR剛剛進入哺乳動物領域就開始嘗試，個人目前的缺點主要在脫靶嚴重，成功率低這兩個方面，正在努力改進

CRISPR最近比較火是因為它的高效快捷，構建也比較方便。在CRISPR出現之前，已經有ZFN和TALEN兩大技術存在，但他們都是蛋白識別DNA序列，構建比較複雜，普通實驗室可能還沒法使用，但CRISPR的出現，直接使用sgRNA識別，方便構建，普通實驗室也都可以使用，所以一下流行起來，甚至很多人預測，這項技術今後會像PCR一樣普遍存在於各個實驗室。

更多內容，可以關注下面這個公眾號，有詳細關於CRISPR的介紹。

http://weixin.qq.com/r/Ojn27lfEugrFrRON92wo (二維碼自動識別)

現在很大的一個關注點在減少genome-wide off target上。現在大家在gRNA序列的選擇上已經經驗值滿滿，各種打分演算法都已經出來了，但是再怎麼優化gRNA，也難以控制genome-wide off target。現在很多團隊已經把目光投向Cas9蛋白本身，嘗試通過點突變提高精確性，而且已經做出了不錯的成果：

Kleinstiver B P, Pattanayak V, Prew M S, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.[J]. Nature, 2016, 529(7587):490.

CRISPR除了樓上講的基因編輯之外還可以做到轉錄調控，在不改變基因序列的情況下實現對基因表達的上調和下調。還可以用於做基因的分型鑒定，我這邊根據sgRNA探針序列錯配的容忍度，可以做到單鹼基突變的檢測。

我先佔個地方，有時間我再詳聊。

這個算是實驗室到商業化的典範了吧

炒得超級熱原因也是為了吸引風投吧

最熱的當然在幹細胞領域。可以ko，可以ki，還是很牛的。比talen什麼的方便了很多。你做個普通的實驗犯不著用crispr，搞點sirna shrna夠用了。