要怎麼才能逐漸掌握HPLC的關鍵技術？

01-06

比如針對不同分析體系的流動相選擇，method的建立之類的具體條件。有什麼推薦的書可以看嘛？我在國外某化學系做博士，助教所在的課程中需要用到這樣的分析方法，但是老師卻不是這方面專長的，花了2個多月才把基線跑平找到樣品峰的出峰位置。。。。

掌握液相的話就是多做，主要在於跟儀器軟體的磨合，還有就是對液相本身這個技術的理解的提升。液相有很多種，但是基本上相通的東西還是很多的，你掌握了其中一種，其他的可以觸類旁通。在做自己不熟悉的分析時，一定注意多看文獻。

我平常做的最多的就是反相HPLC，主要分離多肽，跑梯度。當然還有拆機器進行維護。我認為，想要掌握液相，除了做實驗之外，拆機器也是必須的。看國外大廠做的儀器，那器件的做工和設計，都有學問在裡面。

我建議首先掌握一種HPLC分析方式，然後再擴展。一口氣做好幾種的，對初學尤其不利。

需要考慮的參數太多只能簡單列幾個，具體還請看各類專業書籍（雖然大多很啰嗦不實用）：

一、樣本特徵

1）size

2）polarity：pKa，PI等

3）surface structure

二、找出需要分離的東西和目標樣本之間在以上基本特徵中最大的不同，然後基於這些選擇要用的柱子和基本分離的方法如：（包括但不限於）

1）Ion exchange：靠polarity分離，一般用silican pack柱子。buffer一般從polar到nonpolar

-reverse phase：從nonpolar到polar

2）size exclusive：選合適大小的packing，比大的樣本小，小的樣本大

3）其他：接觸的不多 XD

三、選buffer

1）Ion exchange（IEX，CEX）：

-大部分取決於要分離的樣本，選擇buffer compacity涵蓋了樣本的polarity range的，polar一般是水溶液，nonpolar一般有機溶液

-pH gradient：先用幾個不同的pH度跑一下看看retension time定一個合理的range，再用合適的buffer gradient。理想狀態是AB buffer的mixture能形成一個linear gradient

2）size exclusion對buffer要求不高。。。

四、持任意其他參數不變僅調整其中一個來做method optimization，主要參數有但不限於：

flow rate（linear velocity），sample load，buffer system

（這是個坑。。。慎跳）

五、data analysis

intergration神馬的基本上Agilent的chemstation都自動了，小小改動下參數就行，我一般常用的：signal overlay，intergration slope sensitivity，etc

一般大部分東西都能找到一些相關的HPLC method文獻，除非您研究的sample特別特別unique其他人完全一點沒見過XD 所以在別人的method上做自己的optimization是最有效率的，並不需要從頭啃大部頭教科書。HPLC可以理解為快速自動化過柱子。。。所以，沒有什麼掌握不掌握的，干再多年遇到一個新sample都要重新做一遍method development，所以不必擔心：）

1 液相色譜最重要的東西是色譜柱，我覺得應該從這裡展開，至於具體應用則具體分析。其次必須掌握速率方程，塔板數公式。從理論上解釋所出現的現象。要相信一切現象都有一個邏輯的解釋。不能說出現這種情況我不知道。

2 色譜柱的填料結構也是需要掌握的，因為常常分子基團會跟硅羥基鍵結合而使得峰拖尾。

3 實質上任何知識的學習都需要你有好奇心，對於未知充滿強烈的興趣，但在工作中，我們常常把很多東西當成已知的了，比如用手機，我並不關心裏面的原理是怎樣的。因為我關心了也沒有用。但是在工作中就不行，或者你想進級，就必須學得更多。拿到一個分析方法，我們就會問為什麼流動相這麼設，為什麼使用這種色譜柱。假設你拿到國標，你就知道還有其它國家的標準，別人是怎麼做的，和我們做的有什麼區別？這樣做是不是比我們的要好？當然你還要想到為什麼不能用其它方法來做，比如氣相？比如紫外？所以如果你對這些儀器沒有一個清晰的架構，你肯定就是井底之蛙了。當然我們用液相色譜，使用國標方法去分析物質，這個物質被我們分析了，然後就OK了？然而還有許多東西我們不知道，儀器的構造是什麼，管路系統，怎麼承壓的，怎麼保溫的？通過什麼樣的設置使儀器能夠得到穩定的數據的，通過對比不同廠家的儀器，可能就會學到很多知識。

4 儀器拆裝，當我們掌握了原理，也可以使用HPLC去分析樣品，但是當儀器壞了時候，我們慌了，似乎我們掌握的原理失靈了。你心裡沒底，不敢拆怕壞，需要別人教。實際上工作出來之後所有知識去等別人教，你永遠學不好，你永遠處於被動狀態。不管在愛情，生活，工作中，你都要掌握主動權，不要希望別人幫你完成，也永遠不要有他的技術比我好，我解決不了，他過來了就可以幫我解決得了。儀器壞了，總有一個邏輯上可以解釋的原因，而找個這個可以解釋的原因就可以修好儀器。實質上生活中所有的事情都是如此，你在某方面遇到困難，不自已解決，而去尋求別人幫忙，你就失去一次成長的機會，它也會在你的眼界、能力、機遇上設置了一道牆。這樣的牆越來越多，你現在路可能就越來越窄。直到只剩一條路，而前面有牆，如果你越不過去，你就要折回。向下發展。一般的液相色譜在儀器的結構上還是相對比較簡單，沒有那麼多難的地方。

請參考

如何精通儀器分析，從入門到精通。？ - 蘇靈的回答

如果僅僅是使用、日常維護和簡單故障處理，建議直接參加儀器公司的培訓。他們會從基礎知識講起，比教科書都要好。而且培訓講師一般都是應用經驗豐富的資深使用者。唯一的缺點就是需要花錢。

這個是很專業的問題，不可能在一個答案回答清楚。

作為一個還算複雜的技術活，每個環節都是關鍵。

不了解你的學科背景，如果有化學基礎，並且只是使用設備得些數據或者圖表，簡單看些資料看幾本書就可以使用了，操作方面也不複雜。

但如果你是做這方面的研究，就得靜下心好好專研了。

推薦些相關書籍：

《液相與氣相色譜定量分析使用指南（翻譯版）》（英）庫斯　著，陳小明　等譯

《液相色譜質譜聯用技術在食品和藥品分析中的應用》盛龍生，湯堅　編著

《藥物分析的HPLC安定性指示分析法Stability-Indicating Hplc Methods for Drug Analysis》Quanyun A. Xu　等著

HPLC說白了也就是分離工具的一種，跟TLC區別不大。所以如果你會過柱子，那麼就應該能夠使用HPLC。對於正相柱，極性越大，流速越大，出峰時間越短。不會的話你可以先參考文獻上面的條件跑兩次，熟練了再做未知化合物。

建議做一段時間,分析方面的研發,多想老同事或者工程師請教.

自己想練的話,可以做做藥典裡面那些不同方法.

多接觸些,不同方法,正向,反向.嘗試改變流動相比例的影響,梯度變化,柱溫,流速,波長.

熟悉色譜柱填料性質,孔徑,長度等

熟悉樣品製備對HPLC的影響.

熟悉不同廠商HPLC硬體,和軟體.

熟悉不同檢測器特性,會使用DAD等.

可以研究一些分析方法開發和驗證的資料,特別是方法耐受性方面.

總之多做不同類型的HPLC實驗.

去做幾年儀器公司的應用工程師。三年頂你工作三十年。

高效液相色譜法的關鍵技術在於色譜柱。

試著把分析液相改裝成製備液相就會明白了

上中學的時候體育課是有教材的，有一節講到籃球，投籃的力度只能自己多加練習，沒有技巧和方法可言。說回到化學這個極其不講理的學科，即使是最專業的人士也沒法將原理上的東西講清楚，因為人類對色譜分離技術的理解本身就停留在很膚淺的層面。等你用了三年之後，或許會發現你可以解決日常遇到的70%的問題了，只是剩下的30%也許需要花30年都不一定能解決。如果你有具體的問題，或許這裡有人幫你解決，但是你想要的那種立竿見影的答案，可能這個時代的人類還沒有發現。

用!