CRISPR 到底是一種怎樣的技術？
補充，今年獲獎了：豪華版諾獎：2015生命科學突破獎頒布，CRISPR研究者獲獎
CRISPR 全稱該怎麼理解？到底是怎麼使用的？誰能用通俗的方法給非生物學科的人解釋一下？然後就是這項技術究竟有多大意義？是不是真的是很重要的突破，在未來某時大家治病可以直接修改基因了？--本題已收錄進知乎圓桌 ? 基因解碼，歡迎關注討論。
- CRISPR ; 規律成簇的間隔短迴文重複（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是大多數細菌及古細菌中的一種獲得性免疫方式。
現在使用的CRISPR/cas 9系統是由最簡單的type II CRISPR改造而來，該系統由單鏈的guide RNA和有核酸內切酶活性的Cas 9蛋白構成。下圖解釋其機理：(RE C, SCIE E O F, SOU E. The CRISPR craze[J]. 2013.) - 有什麼用？
通過cas9蛋白形成DNA雙鏈的斷裂，而細胞通過NHEJ的修復會造成INDEL效應（insertion and deletion），進而造成基因的移碼突變而達到基因敲除的目的。此外，還可以通過同源重組等方式達到對基因精確編輯的目的。其實，在此之前已經發展了多種基因的編輯工具，如：ZFN，TALEN等，並且也已經得到廣泛應用。CRISPR則相對較為簡單，廉價，高效，而且可以多處打靶。下圖解釋了幾種基因編輯方式：
(Pauwels K, Podevin N, Breyer D, et al. Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory considerations[J]. New biotechnology, 2013.)此外，在內切酶活性失活的cas9蛋白後加入KRAB/VP64等effector形成融合蛋白，可對下游基因其調控作用，如下圖所示：
(Gilbert L A, Larson M H, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes[J]. Cell, 2013, 154(2): 442-451.)
- 怎麼用？
這一點就應該要看是出於什麼目的了，如果是對於細胞的編輯可通過導入編碼guide RNA和Cas 9的質粒；若是做動物模型一般則是顯微注射RNA。addgene上有現在個實驗室開發出來的載體：Addgene: CRISPR/Cas Plasmids for Genome Editing至於怎麼用於基因治療，我就不是很清楚，這部分還是由大神來答吧。
基因治療可參考這個問題：
能否利用 DNA 的重新編程治療遺傳病或解決人類進化過程中的缺陷？ - 意義
CRISPR可謂是2013年生物界的焦點，這項技術相對與ZFN,TALEN等基因打靶技術可以說是簡便，經濟得多，一般的實驗室都可以構建自己的平台。如果要應用於臨床治療中，其脫靶效應應該是最應該解決的問題。
如Zhou Ziliang所說，用於臨床治療應該還有一段距離。
之前同學發我的一份兒有關這個東東的文章，貼上來：
在表觀遺傳學、幹細胞、癌症研究如火如荼的今天，大家似乎都把目光投入了更加「高等」的生物。然而原核CRISPR系統的發現和應用卻再次證明了「低等」生物的存在感——誰說這些「小東西」不能有精妙複雜的體系？
CRISPR系統不但豐富了我們對於細菌、古細菌生理機制的認知，更重要的是這種體系的改造利用能帶來席捲整個分子生物學領域，更新現有操作模式的一場技術革命。同時，它也為我們打開了一扇窗，從CRISPR的角度重新認識整個微生物世界自我和相互間的調控網路、調控機制，原核及真核細胞間的異同和聯繫，甚至協同進化的證據。
沒人能否認，這次，「小東西」的確搞出了「大名堂」。
一、初露鋒芒，刮目相看
——細菌也有「高級」的獲得性免疫系統
到底什麼是CRISPR？ ——它的中文名很長很拗口，和英文一樣不知道怎麼念，卻能顧名思義，了解其基因序列上的特點，那就是——成簇的、規律間隔的、短迴文、重複序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。 既然是講故事就把關子賣到最後，講到那裡再告訴大家這些定語的含義。
是個啥？
任何偉大事物的開端（原諒我下此斷言，不過看溢美之詞甚盛【21】【22】，也不算過分），任何風雲人物的發家，任何跌宕故事的開始，總是不起眼「其貌不揚」的，我們的主角CRISPR系統也不例外。
很多綜述【3】里都把CRISPR的起源說在了1987年，還是從我們最熟悉的E.coli,最經典的K-12株系中發現的，但是本著挖祖墳的心態費勁找出這篇26年前的文章【7】來考據，卻發現似乎其中只有這一點是與我們的CRISPR沾邊的，就是這個迴文序列。
「叫」個啥？
這個發現純屬偶然，也沒有引起包括發現者本身太大的重視，甚至這種特徵序列都沒有一個名字，直到2002年，在通過計算機操作發現很多原核生物（真細菌和古細菌），都有類似被21-37bp的迴文重複序列間隔開的非重複序列後，他才正式有了這個顧名思義的名字CRISPR，成簇的、規律間隔的、短迴文、重複序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）【8】。並且除了這樣的特徵序列外，在他們的附近還有一寫CRISPR-associated基因。也就是我們後來說的發揮大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。於是我們基本可以得到這樣一張漂亮的模式圖，並清楚了CRISPR系統中最重要的3大元件—spacer（白色方塊），迴文repeats（雙三角），cas等基因。
「干「個啥？
一開始，由於spacer序列種內保守，種間差異的特點，一度甚至現在【30】也在被用來鑒定菌株，回頭看來雖然大材小用，但好歹也是廣泛應用性的體現。
還是和大多數科學發現一樣，CRISPR系統的發現經歷了一個搞清：是個啥？——「叫」個啥？—— 「干」個啥的過程。
現在我們已經知道他長得什麼樣子什麼特點，可是關於這一奇怪序列是幹什麼的，在很長一段時間裡眾說紛紜。
功能顯然和spacer的序列特異性有關，那麼是chromosomal
rearrangement？ modulation of
expression of neighboring genes,target for DNA binding proteins,？replicon partitioning,還是DNA
repair？
都有道理不過只是猜測，直到2005年，3個課題組獨立的數據分析表明——這些spacer是外源DNA來源的，病毒或者質粒。【3】於是才讓大家想，外源DNA，這會不會參與了防禦外來DNA呢？
2007年Streptococcus
thermophilus的實驗證實了這一猜想，於是經過不斷完善，有了我們下面這張華麗麗的示意圖，一個只能用elegant形容的漂亮的免疫過程。
漂亮的獲得性免疫系統——誰說這是「高等」生物的專長？
如何解說這個漂亮的系統，我想參照我們學過的抗原抗體免疫很容易理解，這裡用一個通俗的比喻（如下圖3）簡單講講。
外源DNA就是壞蛋，而抓住壞蛋特徵這一最核心的步驟之一則是——靠的Cas複合體將片段特徵proto-spacer製作成spacer，整合進CRISPR序列中，形成記憶。於是接下來的2次免疫中，spacer便可以快速bingding到proto-spacer上。完成這一target的精確打擊過程。幹掉入侵者。
估計大家也都注意到了一個特別的「帽子「 PAM（下文中也會提到）這裡作為一個防止自身免疫的機理出現，不難想到當然也同時也制約了proto-spacer的選擇。
圖4原核生物CRISPR獲得性系統工作原理圖【3】
怎麼樣？是不是有夠震撼？不誇張的說，這個流程圖真的很衝擊我的舊思想，誰也別「小」看原核生物啊！這麼精妙的，不亞於真核的獲得性免疫，不得不：1、讓我們驚嘆於這個奇妙的世界——造物主和原核小東西們的聰明才智。2、捫心自問——對於自然和生物，我們真的還知道的太少了。
當然，CRISPR也不是原核生物唯一的防禦系統，近期的一篇NAR【15】也橫向總結比較了真細菌與古細菌的各種免疫機制。但是毫無疑問的是，CRISPR的發現極大的擴充了我們對於原核生物生理機制的認知。
跟據最新的官方說法【31】目前，已經在48%的真細菌和95%的古細菌中發現了CRISPR系統。可以算得上是普遍存在了。2007年就有法國的課題組開發了一個CRISPRFinder【12】，讓大家上傳序列，來鑒定該基因組中是否包含CRISPR。從而統計CRISPR的在原核生物中存在的普遍性。（這裡的統計數據和剛才說的有出入，尚未能證實其關係）
圖5 網路工具CRISPRFinder（2013年6月5日截圖）
圖6 各種Type的CRISPR【16】
CRISPR系統也是有很多Type的，不同細菌中含有的CRISPR的type也不一樣。上圖是2013年的一篇非常棒的review當中對幾種type作用機制的整理。（是不是幾年之後絕對入主教科書呢？不入也沒道理啊。）在這裡，也要提醒大家特別注意type-II，因為後面的故事，Cas9將會扮演絕對主角。
似曾相識，本是同根生？
看了上面的流程圖，我想大家都會覺得「面熟」，沒錯，看了下面的一張比較圖，更會覺得原核真核之間機制的相通性。也許，我們的差距沒有想像中那麼大。
圖7和真核RNAi比較Parallels and distinctions between CRISPR RNA-guided silencing systems and
RNAi.【11】
二、 深入了解，為「我」所用，指哪打哪
——Cas9等機理研究和工具改造
故事如果就到這裡，那雖然有趣，充其量也只算是認識自然。其實，真正的好戲才剛剛開始。
隨著CRISPR重要性的逐漸顯現，對它的作用機理研究也一步步深入。【10】【14】【16】各個方面，各種類型的蛋白作用漸漸清楚。比如如何將spacer整合如基因組？【14】中，Csn2作用的模型建立。
圖8 Csn2參與整合spacer模型
移花接木，給細菌打「疫苗」！
於是就有人在想，既然這看起來是個不錯的免疫體系，既然大腸桿菌中這個體系看似不夠強悍，能不能移植啊？
答案是肯定的。2011年，NAR雜誌上，法國的一個課題組【4】正是做了這樣的一件事情——將Streptococcus
thermophilus嗜熱鏈球菌中的Type-II CRISPR系統利用質粒系統移植到了大腸桿菌當中，發揮了作用！於是他們很愉悅的得出了結論——CRISPR是可以用來給細菌打疫苗的，我們了解他的天敵，就可以主動防禦，先發制人。
同時，幾乎是「順帶」，他們還發現了2件事情，
1、Cas9「一粒起效」——作為唯一需要的，足以起作用的剪切蛋白（強悍性充分性）。
2、Cas9「左膀右臂「 ——起作用依賴McrA/HNH- 和RuvC/RNaseH這兩個motif. 。從此Cas9也從那麼多Type【16】的CRISPR的蛋白中，款款走入了我們的視線。
圖9 利用質粒實現Cas9-嗜熱鏈球菌CRISPR系統往大腸桿菌的移植
所以說第一次，他們證明了CRISPR不但可以免疫自己，還可以異源表達，免疫他人，這就是「疫苗」啊，很有意思。
然而從故事的後續發展來看（如果我梳理的邏輯中沒有落掉太多東西），他們實在浪費了一塊寶藏，大材小用了。而這篇文章結果的重要性也被研究者本身嚴重低估了。不能說他們愉悅的結論和細菌的疫苗不重要，只能說他們只看透了一層，沒有看到更深的一層，沒有看得更遠。
為什麼這麼說，因為雖然他們沒看到，但是有人看到了。並且真正成功的奧秘就在於那兩件順帶的發現。
「一粒起效」，果斷改造——從此劍鋒直指！
如果要在CRISPR系統的研究中樹一塊里程碑，我想【2】他是。如果要在這個故事裡有個轉折，我想他【2】也是。從這裡開始，CRISPR的傳奇將開始上演，新一代分子生物學革命的帷幕即將拉開！
2012年8月17，一篇看似低調的Science，看那些膠圖和data也沒什麼意思，這裡用我的語言簡單總結一下他們主要做了些什麼：
是的，流水賬一樣，到這裡這文章看起來沒啥難度，也沒啥亮點。但是，細心地你發現了嗎，到這裡，他們已經一步一步的把Cas9作為定向內切酶的每一步機制，方方面面都搞清楚了。
插一句，又有一個被忽略（至少在這篇文章里沒大動作）的意外驚喜——2個「左膀右臂「domain是各切一條鏈，HNH domain 切 complementary DNA
strand， RuvC-like domain 切 noncomplementary DNA strand 。
接著說，他們把方方面面都搞清楚了，但這僅僅是一個機理研究嗎？錯！他們有非常明確地目的——劍鋒直指！可以人為定製的特異性內切酶！為我所用，指哪打哪。
他們緊接著就利用這些發現，設計，做了體外切割GFP基因的實驗，果然獲得成功。並且都是按照預想的設計的切口切開，這難道不是「想切哪裡切哪裡，媽媽再也不用擔心我的課題」？。
同時，推斷由於限制性的PAM的序列NGG很常見，基本上利用的限制很少——有望可以實現見人殺人，見鬼殺鬼！並且2個必須的RNA已經可以「雙劍合璧」，這樣可以使構建的RNA更方便也更穩定。一個新型「大殺器「呼之欲出。
圖10 crRNA 和
tra crRNA的「雙劍合璧」【2】
（對了，這裡要特別提到的是【13】，和【2】內容非常相似，同年9月4號的PNAS，如果沒什麼意外，應該是晚了一步。看來做科研，不但找准方向，下手穩准狠，動作還要快啊！）
好了，現在已經是「司馬昭之心，路人皆知」了，再笨我們也猜到他們的目的了——構建一個可以按需定製的DNA定點剪切工具。然而又一次，我們要說，技術和發現放在那，決定高度的是你能看多遠。（也有可能他們想到了但還沒做到）
「萬事俱備，只欠東風」。基礎已打好，序幕已拉開，熱場已完成，真正的好戲就要開演了。
三、 「洲」際導彈，秒殺眾生
——多種真核、原核細胞中的基因編輯、合成生物學利器
剛才的序幕估計只是讓關注該領域的人激動興奮了一下（而且好多人也正是從關注這篇文章開始進入領域，開始搶灘），然而真正讓CRISPR系統走進所有人的視野，發出不容忽視的聲音，引發了震動的是接下來的兩篇文章。雖然我們這個故事從頭講下來你覺得彷彿有此文章順理成章，但是乍一看，兩篇文章的成果實在太誘人，太漂亮了。也的確，短短5個月，向前邁進了一大步，重要的一大步。
雖然說是2篇文章，意義卻是一個，他倆很有意思，背靠背，連著印在同期的Science上，一前一後。第1篇【1】就是叢樂學長的文章了，而第2篇【17】來頭也不小，是George M. Church課題組的作品。
（應該說，可以看出第二篇文章幾乎是被第一篇的文章「逼」出來的，有種趕著發沒有well-organized的感覺，但其實做了很多東西，具體後面再說。其實還有杯具的同樣的第3篇【18】，來晚一步，只好nature子刊了。）
這2篇文章的突破就是——在人類細胞中，成功實現了由Cas9介導的基因組定向編輯。
（注意是編輯，而非簡單地剪切。嗯，Genome
Editing，是不是聽起來就高端大氣上檔次。）
「洲」際導彈，深入敵鏡，精確制導，圓滿完成
圖11 組裝導彈，直入腹地---入核導彈系統【1】
先來看看第1篇，第2篇的異同稍後再表。想在真核內實現基因組的編輯，第一步就是要進核。NLS就是潛入目標的偽裝，戴了 2個帽子，一頭直入腹地。當然導彈必備的爆破裝置Cas9和定位裝置crRNA等也必在導彈組成中。
調試導彈，精簡裝備
順利完成第一波實驗，繼續調試導彈，居然有驚喜——裝備是可以精簡的，RNaseIII不是必須的，因為估計「不明真相的群眾」也就是人類細胞內的同樣蛋白是可以幫忙的！
同時也發現「制導」位置不同，在一個loci中target的序列不同，效率也不同。他們也嘗試了雙劍合璧，但是發現組合制導效率略低。
圖12 變「戰後重建」為「和平殖民」，減少毒性———用HR插入新東西【1】
這是很贊的一步，這裡就充分利用了我們說的一個domain切一條鏈的發現，變雙鏈切斷為切開單鏈的一個口，再導入外源片段，從而介導HR，通過重組的方式實現片段替換——從而插入，刪除，等等，都成為了可能。
圖13 「萬箭齊發」同時一塊兒切【1】
另一幅讓人激動不已的途徑就是可以萬箭齊發，而這也充分利用了CRISPR系統本身的特性——人家本來就是個array嘛。
當然，還有比較容易想到的就是下面這種刪除方式：
圖14 切兩頭，直接刪除一段【1】
總之一句話——導彈在你手，想怎麼玩，就怎麼玩！
講完了叢樂的文章，下面就說說第2篇文章與叢樂文章的不同之處——
1、用且只用「雙劍合璧裝」guide RNA
(gRNA) 圖15【17】
2、鑒定體系用的是 GFP rescue，更漂亮圖16【17】
3、做且只做 human cells 更多關注在人細胞中（包括iPS
cell）的實際應用。
4、做了龐大規模的生信設計，目標針對整個基因組水平設計全幾組靶標，覆蓋近一半基因。（野心很大啊，名家風範）
5、與ZFNs ，TALEN 比較的實驗更多。
6、工作量更大，數據量更大。
所以看來，動手快是多麼重要，差點到手的鴨子被別人搶了總是不好的，然追求完美也是有價值的。
此劍一出，誰與爭鋒
最後簡單總結一下，這目前為止，故事的高潮部分是這個樣子——
1、
實現真核細胞體內的基因組編輯，而且一下子打通關了，直接搞定了終極目標——「大boss」human cells
2、利用單鏈切除介導HR（同源重組），變單純的切為定向編輯：想插入，改寫，刪除，全部滿足你
3、實現「萬箭齊發」 ，別再打一槍裝一次子彈了，咱已然進入機關槍時代了。
4、證實了與TALEN比的優越性（大家都懂得，其實即使在效率差不多的情況下，無需新編碼蛋白而是換短序列即可的Cas9，比TALEN有著不可逆轉的便捷性優勢）
總之，我們獲得了一種想打哪裡只需要換「定位彈芯」-gRNA 就行的基因導彈，定點、準確、體內體外、原核真核都可以。更重要的是方便、便宜（「幾個質粒就OK」）。
如此利器，預示前景一片大好，自然各家不吝溢美之詞【20】【21】【22】【23】【29】。
有人歡喜有人憂，你方唱罷我登場——更高、更快、更強
如果說Cas9開啟了一個基因分子生物學的新時代，大家都開心還來不及，只有一個人哭的話，那就一定是TALEN相關公司了。
正所謂「長江後浪推前浪，前浪死在沙灘上」，科學也有更新換代，算是自然規律使然。Cas9無論是從理論分析，可行性便捷性，還是實際結果，效率上都輕鬆的「秒殺」了前任明星——TALEN。【1】【17】【19】【21】.
沒辦法，在秉承了「更高、更快、更強」精神的Cas9同學面前，曾經風光無限的TALEN同學只能默默垂淚離去，剩下一堆公司做好準備血本無歸了。
百花齊放，四海皆準
Human這個大boss都搞掂了，剩下的估計問題不大。也的確是這樣，一時間，各種物種體內的Cas9運用文章嘩啦啦的冒出來——斑馬魚【24】酵母【25】小鼠（多基因同時，還是叢樂老闆課題組的作品）【26】細菌（仍然是叢樂老闆課題組作品）【27】，Cas9大熱正式出現。
眼看，一個Cas9的時代就這樣到來了。
精確定位，潛力無窮
其實，Cas9的成功給了我們一個運用CRISPR系統方便快捷定位基因序列的可能，但僅僅局限於編輯基因嗎？其實可以做的遠不止於此。
圖17 利用Cas9定位控制轉錄【28】
比如可以利用這種特異性，做有針對性的表達調控【28】，比如利用雙切致死性「自動」篩選突變株【27】。未來，也許還有更多應用，開動腦筋改造他，還有很大潛力。
四、驚喜連連，奇妙繼續
——CRISPR系統在各個層次的廣泛性與給我們的認知拓展
主觀來講，一個好故事的結尾總是留有懸念的開放式，為了講個好故事，我們的CRISPR也不負重望，更多發現，讓我再多寫一節。
客觀來講，能夠開啟一個分子生物學的新局面已經夠牛氣了，可是偏偏人家還有更大的使命——讓我們繼續思考原核的種種，調控網路的種種。
道高一尺魔高一丈——病毒抗CRISPR系統機制
有個問題不知道大家有沒有想過，如果CRISPR在原核生物中真的那麼所向披靡，那噬菌體、病毒對於細菌早就沒任何威脅能力了，早就給幹掉了。「這不科學啊」~
俗話說「道高一尺魔高一丈」，你細菌能有CRISPR對付我病毒，我病毒也必然有一套甚至幾套機理來對付你。【6】【31】
「別拿豆包不當乾糧」，別拿病毒不當生命，人家不但能「借屍還魂」繁殖自己，連特異性的免疫系統，都是可以有的！
奧特曼與小怪獸共同成長———軍備競賽，協同進化
正如這個有趣的題目CRISPR-mediated phage
resistance and the ghost of coevolution past【33】，讓我們感興趣的是CRISPR系統中那些細菌病毒協同進化的證據。【31】中噬菌體對抗CRISPR基因來源等表明，細菌和噬菌體簡直「你中有我」「我中有你」，不斷競爭，共同成長。
想一想，大自然的法則多麼有哲學意義啊！
苦肉計——自身抗逆，作用比我們想的更多
更玄妙的機制是這個「苦肉計」——細菌通過CRISPR調節自身基因，幫助自己躲避哺乳動物的免疫系統。
2013年4月的一篇文章【5】表明細菌Francisella novicida的傳染力依賴自身的CRISPR系統。 在哺乳動物細胞內生長時，細菌會通過CRISPR系統關閉自身脂蛋白的合成基因，以避免被宿主免疫系統發現並摧毀。
「如果將宿主的免疫細胞比作大海中的鯊魚，那麼對於它們來說，細菌脂蛋白就如同海水裡的血一般充滿著吸引力。因此，為了不被免疫系統發現，細菌就必須關閉脂蛋白的生產。」
太神奇了！
「除了切割噬菌體基因以外，Cas9還能夠調節細菌基因，這是一項新發現，」
看來CRISPR系統是一種原核生物間、原核和真核之間綜合性的調控網路的中心，是原核生物抵禦外界不良環境的手段方法，並非切切外源基因那麼簡單。也給了我們一個機會，讓我們從CRISPR的角度重新認識一下奇妙的「微生物界」。
當然，還有更多關於CRISPR的報道【32】引導我們繼續去關注。
「小東西」搞出「大名堂」故事的「啟示」
好啦，故事講到這裡也差不多了，是時候總結一下啦，故事梗概如圖所示，多說一遍也沒啥意思。
「不幸的各有各的不幸，幸運的都差不多一個樣子。」其實想想，也許這就是一個nice的科學故事該有的pattern——從最初一片草莽中被慧眼識英雄，到研究不斷深化，打開一片認知新天地，甚至改寫固有「教科書」，改變固有觀念。而後派上用場，為更多研究服務。並且同時開啟一個新領域，新視野。
然而這個故事的意義還在於提醒我們怎麼做好的研究，回顧整個故事，其實無論在哪裡及時進入有所建樹都是很好的研究。關鍵在於如何敏銳的發現這自然寶藏的價值所在，看得比別人遠，下手比別人早，而且動作比別人快。
自然界有很多寶藏，怪不得venter要下海去找。我們可以不去找，就盯著那些出土的，嗅覺靈敏，慧眼識珠，有了make a difference的機遇，果斷抓住！
希望再有這樣的好「戲」，我們不但在台上，唱的還是高潮部分~
瀉藥
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）就是細菌體內的一串DNA序列，CRISPR系統還包括了一系列與之功能相關的蛋白。
CRISPR在細菌體內本來是起適應性免疫作用的（有點像人的獲得性免疫）。細菌也是會被得傳染病的嘛。細菌被病毒感染了，當然也不會束手就擒。病毒感染細菌，對於細菌而言就是細胞內多了一些不是自己的DNA序列，這些序列可能表達出一些對細菌本身有害的的蛋白，所以細菌只要把這些外來的DNA破壞掉就可以了。
CRISPR就是這麼一套很巧妙的系統。它先把外來DNA的片段整合進細菌自己的基因組，然後轉錄出RNA，經過一些剪切之後，利用這些RNA把帶有DNA內切酶活性的Cas蛋白直接引導到外源序列的位置，於是，外源DNA就可以被剪斷。對於細菌而言，就完成了對外來病原體的快速精確打擊。這些整合進基因組的序列還可以傳給子代細菌（要是人的免疫可以這麼遺傳，就不用每個小孩都拉去打疫苗了），所以CRISPR現在也被用作微生物分類的一個依據。至於最近很火的CRISPR技術其實是利用了CRISPR系統中的RNA引導Cas蛋白去切斷目標DNA的這一個步驟。如果破壞的是自己的基因，不就是達到了基因敲除的作用了嘛。
當然CRISPR的爆紅主要是還是因為這套技術好用，一方面是省時間，一方面是精度高。省時間是因為要達成基因敲除的目的，只需把兩段序列導入細胞就大功告成了。一段序列是Cas9蛋白的基因，它是可以切斷DNA雙鏈，就算是DNA有甲基化也照樣切。另一段用來轉錄一條RNA，前一部分是與目標基因配對的，後一半用來與蛋白結合，這樣就把Cas9拉過來，切斷目標基因。切斷了之後，對於真核細胞，各種修復手段就上了，結果通常是基因中間被插入或者刪除了幾個鹼基，這樣整個基因的編碼就全亂了，基因也就沒有原來的功能了，也就是完成了基因敲除。至於精度嘛，20個鹼基的長度定位一個基因一般是沒問題的，還有就只能感嘆Cas9這個蛋白的神奇了。
還有更神奇的，如果把Cas9蛋白的DNA內切酶活性滅掉，再給它加上別的催化活性，它就可以有別的功能。目前，抑制和促進基因表達都可以做到了。啊？提問里還有意義？
呆逼理科生最不會寫意義之類的東西。個人覺得CRISPR首先是一個很好用的系統，在基礎研究上可以為研究人員節約不少時間，提高產出效率，也節約了科研經費。那都是納稅人的錢呀！還有，CRISPR提供了一個應用面很廣的技術平台，多種基因操作和調控都可以通過對CRISPR系統的優化來實現，應用前景一片大好。至少現在看來是很好。現在科研也是一個不小的市場，而CRISPR很有可能就是即將改變這個市場格局的技術。科研上用好了，自然會被用到工業和農業上。至於臨床應用，肯定是用很長一段路要走的啦。贊成@Zhou Ziliang 的看法。平安夜碼字求點贊！聖誕快樂！謝邀。以前conditioned gene knock-out是要用loxp和cre這兩個搭檔的，CRISPR出現後好像是更方便（號稱one step）而且可以同時target多個基因，而且可以修改後用於片段的插入改寫，不限於刪除。我記得校內有個帖子review過這個玩意。這裡給出連接http://blog.renren.com/blog/247884829/917457936，希望有所幫助。通俗地來說，能編輯人類細胞的基因組片段了，刪除插入改寫鹼基好像都ok。2013年這個技術爆發了多篇CNS文章，從酵母細菌到人類細胞，不僅能編輯而且能篩選，實乃實驗室必備技術了。好像有位發現者還開了家公司了已經。人類有一些疾病是遺傳病，其中又有些是單基因遺傳病，要是能做到全身或者至少表達這個基因的細胞內的特異性編輯，可能就能治癒這些疾病。但是，至少先要解決off target的問題，然後還有很多期的臨床試驗。想想23andMe現在都受到FDA的管制了，直接in vivo編輯人體細胞DNA以用於臨床我想還是有很長距離，10年之內能成功就不錯了。鑒於平安夜，暫時就不查review鏈接了，我想明年肯定好多好多篇...這裡給出我搜到的掛網上的全文，雖然不是review，但可以在intro和discuss裡面找找作者自己號稱的種種好處，就當看廣告吧http://bms.ucsf.edu/sites/ucsf-bms.ixm.ca/files/20131031.kostova.kamena.pdf
第一個問題大家都說很多，我也學到了很多，我就不獻醜了。
第二個問題我要來潑一下冷水——個人比較悲觀：推動作用有限。
原因主要是其他答主也有提到的脫靶問題。
並且在我看來，脫靶問題不可能很好地解決，因為CRISPR本身是一種免疫系統。免疫系統是不能太精確的——因為那樣任何免疫原只要發生一點點最細微的變化，免疫系統就對它無能為力了，這樣的免疫系統是形同虛設的。相反，有一定程度脫靶效應的免疫系統在免疫原發生細微改變的時候仍然能夠生效。後者在進化上更有優勢。謝邀~
因為上面已經詳細介紹了CRISPR技術，我就說下CRISPR的應用。
CRISPR是目前用於基因編輯（genome editing）最有效最cheap，也就是最實用的方法。基因編輯，簡而言之，編輯基因組，對於致力於探索基因功能和基因組改造的科學家來說，基因編輯就是入門基礎，是目前為止最直接的手段。基因編輯經過了幾十年的飛速發展，從傳統手段到今天的CRISPR/Cas系統【見下圖】，每一次技術的革新都是令人興奮的。
ps：個人認為此技術應在未來獲諾貝爾提名，獲獎的話應有張峰一份，嘻嘻
以上為個人拙見，如有不當，請各位指正~之前自己在微信平台上寫過的一篇小文。貼過來....基因治療如何創造奇蹟
2015年11月5日英國包括&<&<每日郵報&>&>、 &<&<鏡報&>&>在內的多家報紙報道了世界上首例嬰兒白血病患者被成功治癒的奇蹟。去年6月，可愛的Layla Richards 誕生於倫敦的北部，然而三個月後，Layla開始患病，醫生通過血液檢測將其確診為急性淋巴白血病患者。疾病確診後，Layla 接受了化療，骨髓移植等傳統治療方法，但不幸的是這些治療方法對於Layla的病情緩解並沒有幫助。在醫生宣布了Layla的治療無望後，Layla的父母卻並沒有放棄。相反，他們允許倫敦Great Ormond Street醫院的醫生採用德國生物技術公司Cellectis開創的細胞治療方法治療Layla。事實上這種方法尚沒有應用在臨床，之前僅在老鼠身上做過測試。今年6月份，醫生將1毫升基因編輯過的5000萬個細胞注入了Layla的體內。奇蹟發生了，幾周後Layla 開始出現好轉的跡象，如今檢測結果發現Layla身體內的癌細胞已經完全消失了。
基因編輯技術如何創造奇蹟？
那麼醫生具體是怎麼對Layla進行治療的呢？醫生給Layal注射的血細胞來自美國的一個隨機的捐獻者。科學家對這些細胞進行了三種形式的修改。首先，這些血細胞內被注入了抗白血病基因，這些基因可以編碼靶向追蹤並殺死癌細胞的蛋白質。其次，科學家關閉了血細胞內的兩個基因，關閉其中一個基因是為了確保注射的細胞不被Layla 身體排斥，關閉的另一個基因是為了確保捐贈的細胞不被藥物殺死。今年6月份，醫生將編輯過的血細胞注入Layla體內，經過三個月，這些細胞尋找並殺死了癌症細胞。9月份，醫生又重新對Layla進行了骨髓移植，新的骨髓重新開始生產健康的血液細胞，而捐獻的細胞在骨髓移植過程中將會喪生
基因編輯技術的新寵
在Layla治療過程，基因工程編輯過的細胞無疑是最重要的因素。那麼基因是如何被編輯的呢？ 注射到Layla體內的細胞是通過一種叫做TALENs的新型基因編輯技術進行的。這項技術極為複雜，普通的實驗室是無法進行的，只有藉助商業公司完成。想在這裡介紹有第三代基因編輯技術之稱得GRISPR/Cas9系統。
所謂基因編輯技術，是指對DNA核苷酸序列進行刪除和插入等操作。CRISPR-Cas9系統並非天生就是為人類使用而產生的。它的本質其實是細菌中一種對付諸如病毒等外來DNA的防禦系統。CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是生命進化歷史上，細菌和病毒進行鬥爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因複製服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統。微生物學家10年前就掌握了細菌擁有多種切除外來病毒基因的免疫功能，其中比較典型的模式是依靠一個複合物，該複合物能在一段RNA指導下，定向尋找目標DNA序列，然後將該序列進行切除。許多細菌免疫複合物都相對複雜，其中科學家掌握了對一種蛋白Cas9的操作技術，並先後對多種目標細胞DNA進行切除。這種技術被稱為CRISPR/Cas9基因編輯系統，迅速成為生命科學最熱門的技術。
CRISPR/Cas9應用前景
在過去的3年里，基因編輯神器CRISPR被認為是遺傳研究領域的革命性技術；科學家用它來編輯農作物、家畜甚至是人類胚胎。一些公司如雨後春筍般出現，開發基於CRISPR的基因療法。有科學家表示，此類療法的首次臨床試驗會在接下來的一到兩年內進行。這些首批試驗或許將勾勒出CRISPR的應用場景，即CRISPR成分能被直接注入眼睛等器官，或者細胞能從人體移除並在實驗室中進行基因改造後被放回體內。例如，形成血液的幹細胞可能被修正用於治療諸如鐮狀細胞性貧血症或β-地中海貧血等疾病。雖然將酶和引導性RNA送入很多其他組織將是一項更大的挑戰，但研究人員希望有一天這項技術能被用於解決更廣范的遺傳疾病。
CRISPR/Cas9技術是一項正在發展中的新興技術，仍然存在一些缺陷，如脫靶效應，系統效率和特異性受不同物種或同一物種的不同基因影響等因素。然而，作為一項新技術，縱然還有許多問題有待解決與發展，也給研究人員以更廣闊空間去進行探索和研究，不斷發現、發展該項技術的更多更大的優勢。未來，CRISPR/Cas技術會在實驗室中得到廣泛的推廣，並成為科研人員了解生物、在改造基因，解決更多的問題的一項常規的應用手段。
自己製作了一個比較通俗的科普小視頻，有不準確的地方歡迎大家指出：
科普：什麼是基因編輯技術？ - 騰訊視頻視頻
當細菌們遇到病毒入侵的時候，它們的體內會被注入病毒的DNA。這對細菌來說是致命的。因此，一旦被入侵，細菌就會想盡辦法消滅敵人。
這時候，細菌們會像電影里的特工一樣，快速地在自己的資料庫中識別出通緝犯——也就是病毒的DNA，並把這個通緝犯的信息輸入到一個導航系統里；
同時，細菌還會派出一位殺手：一個胖胖的蛋白質（Cas9），讓它在第一時間，帶著導航去抓通緝犯，並把通緝犯，也就是病毒的DNA，無情地一刀剪斷。
這樣，細菌的小命就保住了。以上就是CRISPR系統在自然界的工作原理。
而在人類文明中，通過操縱CRISPR這把基因剪刀，科學家們不僅可以對基因進行人為的剪切或修改；而且還可以極其精準地改造任意一段基因。
比如這種小老鼠，只要對它7號染色體上的一個基因（Tyr）做一點小小的改變，本來應該是黑色的小老鼠，就會長出白色的毛來；
而通過改造一種蚊子的基因，科學家們可以有效抑制瘧疾的傳播；此外，還可以對植物的基因進行改造，改良品種，提高產量。
2015年，一位叫亓磊的華人科學家還發現，CRISPR系統里那個胖胖的蛋白質，除了可以做剪刀殺手之外，竟然還能做快遞小哥——
剛才我們已經說了，這個蛋白質，在正常情況下，會隨身帶著導航，去把通緝犯給一刀剪斷。
但如果科學家命令它不能殺死通緝犯，而只是按照人的指令，去給特定目標傳遞信息呢？比如「打開A基因」、「關閉B基因」、「癌細胞去死」等等。
那麼現在，這個蛋白質，實際上就變成了給人類跑腿兒的使者。這麼一來，人類甚至都可以直接和癌症對上話了。
當然，基因編輯治療疾病目前還處於研究階段，而且還有很多倫理上的爭議。但不得不說，如果有一天人類能精確操控基因，並且能把這種技術用在正道上，造福人類，那真的是太好了。
CRISPR具體的來龍去買就不講了，高票答案已經給的很詳細了。回答一下第二個問題：是否能推動基因治療？個人認為對某些特定疾病，如HIV感染，是能起到神奇的治療效果的。但是目前仍然需要進一步解決兩個問題，一是脫靶問題，該問題我持樂觀態度。我並不認為CRISPR本身能變的更精確，但是我認為通過巧妙的設計和嚴格的篩選、過濾，我們能做到基因組編輯效率與脫靶之間的平衡。二是CRISPR治療疾病的具體問題。疾病類型不一樣，需要的治療方式也不一樣。所以，肯定有一部分疾病是CRISPR，甚至基因治療方法無能為力的。而CRISPR有潛力治癒的疾病，也需要摸索合適的質量方式，尤其需要與其他技術良好的整合。換句話說，基因治療只能個案化，或者以針對某種特定疾病的方式來發展。因為大部分疾病，修改了基因，也沒啥么亂用。
做一個實誠的回答者。不扯那麼多概念：
1，CRISPR 全稱該怎麼理解？
---全稱你就不用記了，我都參與了一些這方面的工作，都還記不住。就把它理解成一種可以對「基因進行編輯方法」（一般用於基因的突變比較多）就好了。2，到底是怎麼使用的？
---根據你想要突變的基因序列，設計一段特異性的序列。轉入一種DNA載體（環形DNA序列）中。然後，把這個載體轉入目的細胞中，就會啟動，幫你突變你想要突變的基因位點，使這個基因失去功能。3，然後就是這項技術究竟有多大意義？
---潛在意義很大，但是現在想用來治病還不行，估計還需要一些年頭。在人身上整不容易，涉及到很多問題。但是用來做動植物育種，還是可以有的，尤其是植物育種，隨便整也不會涉及到什麼倫理問題，保護小動物問題。而且植物是無性繁殖。做轉基因的方式也很多。舉個栗子：如果某種病原菌攻擊植物裡面的某個基因，來使植物得病。那麼我們就用這種技術，定向的突變掉這個被病原菌攻擊的基因，就可以讓植物不得病了。
而且這種技術不引入外源基因，不像將細菌的BT蛋白基因轉入植物抗病，人總覺得細菌的抗蟲蛋白不安全（實際上很安全）。這種技術只是對植物本身的基因進行了修飾，和自然突變一樣。所以編碼了轉基因糾結中的這個問題。4，是不是真的是很重要的突破，在未來某時大家治病可以直接修改基因了？---算是一個重要的突破。未來治病也有可能。這個我是外行，但是個人感覺很難治很多病。因為一旦人發育成型了，身體那麼多細胞，不可能每個細胞都用這個玩意來修改。就算修改了一部分，那麼細胞有周期的，凋亡了，新生細胞是不是含有修改夠的細胞呢？？？這些問題都需要解決，或許有別的方式解決。看到很多人都在討論什麼off target的問題
臨床角度來看，我有一個很簡單的最重要的問題：
對於成年的各種家族遺傳性突變導致的疾病病人，請問臨床上如何in vivo改變一個成年活體的全身體的DNA 呢？技術上如何執行？因為看到的文獻，很多是針對cell line的，或者是在一個embryonic stem cell上做手腳然後產生一個mice的。可是在臨床上這個都不是最關鍵的最關鍵的還是在成年活體病人身上的實驗，把Cas9/gRNA做成drug通過吃藥打針送入身體？關於CRISPR的原理和介紹，請參照 @林宇翔
關於應用以及意義，還有相當長的路要走：
1，研究上的突破：目前該技術還處於研究的階段，雖然很熱，但是離應用還有很多關鍵問題要解決；另外關於基因和疾病的聯繫，拿最簡單的單基因病為例，不到3000種疾病能得到相關基因突變，癌症，糖尿病，心臟病等這些更是眾多基因參與的調控過程；2，民眾接受程度：一個轉基因水稻大家都接受不了，更何況直接用到人身上了。那真的是像剛看的電影那樣，都是變異人了。看了各位大神的答案，然後我覺得如果題主你不是學生物學科的話，是完全理解不了這種東西的。=_=真的好專業。我決定用一種真的很好懂的方法來講（堅定的知乎手機用戶，排版什麼的請忽略）。你以前肯定學過DNA雙螺旋結構吧？你知道DNA是由兩條鏈組成的對吧？這兩條鏈呢，是由ATCG四種鹼基組成的（我覺得這個你估計也知道，不知道忘了沒）。它們就跟火車車廂一樣挨個連在一起，然後其中連續的若干個車廂算一個火車，這列火車的意思就是可以合成一個蛋白質。這個技術呢，就是把火車的某幾節車廂去掉了，雖然剩下的車廂還能連起來，但是這列火車就沒有卧鋪or餐車or硬座車廂了，然後它就不是一個完整的火車了，就不能合成原來的蛋白質了。大概原理就是這樣，不過說實話，這項技術要運用到人體身上還是需要相當長的時間的，雖然我只學植物，但是我也知道實驗室內的技術如果要應用在生活中的話，要求是非常之高的，需要完全沒有後顧之憂沒有後遺症，但是這項技術確實是一個相當有前途的技術～（我只是個學渣，而且我也並沒有在使用和學習這項技術，也只是知道個大概，如果有大神看不下去了請毫不客氣的指正～(?? . ??)）
This widespread adoption has been largely fueled by the emergence of the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) technology, an important new approach for generating RNA-guided nucleases, such as Cas9, with customizable specificities. Genome editing mediated by these nucleases has been used to rapidly, easily and efficiently modify endogenous genes in a wide variety of biomedically important cell types and in organisms that have traditionally been challenging to manipulate genetically. Furthermore, a modified version of the CRISPR-Cas9 system has been developed to recruit heterologous domains that can regulate endogenous gene expression or label specific genomic loci in living cells. Although the genome-wide specificities of CRISPR-Cas9 systems remain to be fully defined, the power of these systems to perform targeted, highly efficient alterations of genome sequence and gene expression will undoubtedly transform biological research and spur the development of novel molecular therapeutics for human disease.
大家不用激動！這種技術沒有前途的。原因就是脫靶太嚴重！其實想想就知道，人類基因組10億鹼基對，而他的靶標才20個左右。會有非常多的錯配。這個技術的優點也是缺點！高效意味著高脫靶率！不知道你們了解傳統重組技術嗎？要用幾k的同源序列導引，這個才是正道。現在的人太急功近利了！國外的也是，誘惑太大，都是去騙錢的！
其實CRISPR這個現象，很早就被發現了，但是在真核細胞中的成功運用是最近的事。而且效率高是相對與之前的TALEN之類的技術。今年的幾篇文獻上說在動物中的效率可以到30%以上，但據我周圍的一些實驗室講，他們做的效率還是不到10%。而且這個系統在植物中的效率也比較低，個位數的百分比吧，據說我們學校的某實驗室在煙草中已經有了不到5%的轉化效率，已經算很不錯了。
用一個兩分鐘的視頻，直觀回答你的問題。
CRISPR技術雖然是現階段生物界非常新而且非常熱門的一門技術, 在各大門戶網站上有很多文章已經對於此項技術進行了詳細的介紹. 但是本篇文章本著簡潔, 通俗易懂的理念, 將細緻的介紹CRISPR的相關概念並且闡述作者自身對於CRISPR這門技術的理解. 適合剛剛接觸CRISPR系統的人進行學習探討.
在本文中, 我將介紹什麼是CRISPR 系統, 其結構特點和作用機制. 同時也會概括性的介紹CRISPR 在現階段的應用, 和gene drive(基因驅動) 技術.
(1) CRISPR/Cas: 強大的基因組編輯工具
精準, 簡便的對於基因或者基因組的信息進行編輯對於生物學家了解生物體內的代謝過程, 生物體內基因的功能研究和現代基因治療都有著至關重要的作用. 之前的基因組編輯技術, 例如鋅指蛋白 (Zinc Finger, ZFNs)和轉錄激活因子樣效應物
(Transcription activator-like effector, TALENs) 對於基因組編輯的發展做出了不可磨滅的貢獻. 在這兩種技術當中, 基因編輯的工具在基因組上的定位依靠蛋白質與DNA之間的相互反應, 而對於基因組的剪切過程依靠Fokl蛋白. 圖一中, 彩色的圓形或橢圓形代表了合成的錨定蛋白 (Fig.1). 但是錨定過程依靠DNA 與蛋白質相互作用的一個顯著的缺點就是當要錨定新的基因位置時,需要對於錨定蛋白進行重新設計和合成, 這大大的加大了基因編輯的工作量和難度, 使這些技術較難適應高通量的基因組編輯工程.
Figure 1: Zinc Finger, ZFNs and Transcription activator-like effector, TALENs) technologies.
CRISPR/Cas系統作為一個革新性的強大基因組編輯工具的出現改變了這一境況, 可以說是顛覆了基因組編輯這個領域. CRISPR的全名是 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), 中文意思是成簇的, 規律間隔的,短迴文重複序列. Cas 所指的是
(CRISPR-associated). 與上述的工具之間的不同之處是, CRISPR/Cas系統對於基因組上基因的定位利用RNA 與DNA 之間的相互作用, 對於新基因位置的錨定只需要一小段新的RNA序列, 這個特點大大的減少了新和成蛋白的工作量, 且特異性是很高的. 具體的機制在下文會有介紹. CRISPR/Cas系統之所以成為基因組編輯界的新寵是因為這個工具具有很多其他工具不具備的優點, 例如, 合成簡便, 使用方便, 低費用,特異性高等.(2) CRISPR/Cas系統的結構
CRISPR/Cas系統是細菌體內的獲得性免疫系統, 是用來對抗侵略細菌的外源DNA, 質粒和噬菌體的. 與普通的原核生物的general的免疫系統不一樣, CRISPR/Cas系統是獲得性免疫系統, 這就意味著這個免疫系統是具備「記憶性」的. 他可以記住入侵過的外源DNA 和噬菌體, 並在他們再次入侵的時候切斷他們基因組, 被切斷的基因組將變為線性,無法進行複製和表達,並被細菌體內的酶降解掉. 這個免疫系統雖說簡單, 但是卻非常實用且強大.
CRISPR 系統是一個什麼樣的結構呢. 簡而言之, CRISPR/Cas系統由兩大部分組成: 第一個部分是編碼Cas相關蛋白質的基因(在Fig.2中的白色方塊箭頭), 這些Cas蛋白在獲得外源基因片段和剪切外源基因上都起著重要的作用. 第二大部分被稱為CRISPR array, 這個部分中包含了repeat序列和spacer序列, 這兩種不同的序列是間隔開來的, 本著兩個repeat序列夾一個spacer序列, 正如Fig.2所示, 黑色菱形代表repeat序列, 不同顏色的方形則代表了不同的spacer序列. Repeat序列在同一細菌中的鹼基組成和長度是相對保守的, 基本不變. 在不同的細菌之間會有些許差異. Spacer序列則是用來錨定目的外源基因的, 所以spacer的序列鹼基組成差異較大, 因為他們來自於不同的外源基因. Spacer 基因當中包含著被錨定基因組中的特異性高的保守序列, 確保在之後轉錄出的RNA 可以與被錨定基因組精確配對. CRISPR array之前通常會有一個富含A-T的leader sequence, 這個序列中包含啟動子, 是用來啟動repeat 和spacer序列轉錄的. CRISPR array 不包含閱讀框(ORF, open reading frame).
Figure 2. General CRISPR/Cas system locus.
(3) CRISPR/Cas 系統的作用機制
CRISPR/Cas的作用機制可以分為兩個主要的部分: Adaptation和Interference. 第一個大部分Adaptation根據我的理解可以又分為兩個小部分, 分別是Spacer序列的獲取和CRISPR RNA
(CrRNA)的合成加工. 下面對於作用機制的解釋基於Fig.3.1. Adaptation: Spacer的獲得
當噬菌體或者外源基因侵入到細菌體內後, 其基因組中的protospacer會被CRISPR/Cas系統中的cas相關基因進行識別而剪切. Cas蛋白對於spacer的識別獲取基於其序列下游的PAM (Protospacer adjacent motif) 序列, PAM 序列在spacer獲取和CRISPR系統的體外設計中都起著至關重要的作用. 不同的CRISPR/Cas系統的PAM識別序列也是不同的. 當Cas相關的蛋白選擇spacer後, 會把其基因剪切下來, 並插入到leader序列和相鄰的repeat的中間, 形成新的spacer. 這樣, 下次同樣的外源基因入侵時, 就可以對其基因組進行剪切了. Spacer的前面是需要有repeat的, 這和後面形成城成熟的CRISPR RNA 很重要. 為了不影響讀者對於機制一個大概的理解, 新插入的spacer前是如何形成新的repeat序列的, 作者將在Appendix1中作介紹.
Figure 3. Adaptation process, including spacers acquisition and crRNA biogenesis.
2. Adaptation: CRISPR RNA (CrRNA) 的形成
之前提到過, leader sequence中具有啟動子, 可以啟動後面CRISPR array的轉錄, 這個轉錄是連續的. 因此轉錄出的RNA 產物是一條長鏈, 其中包含了CRISPR array中所有的spacers和repeats, 這條長鏈RNA 被稱為precursor transcript (pre-crRNA). 如Fig.4所示, 長鏈pre-crRNA會隨之被細菌體內的管家基因表達的酶或者Cas相關的蛋白(取決於CRISPR系統的差異)所加工剪切, 使之稱為成熟的, 含單一spacer的crRNA. 轉錄出來的spacer RNA 序列是和目的錨定基因互補的, crRNA 可以引導Cas相關的蛋白去剪切目的基因組中的基因.
Figure 4. crRNA biogenesis
3. Stage II: interference
在成熟的單一spacer的crRNA形成之後, 其會與Cas相關蛋白和其他的RNA 組分組成一個複合物, crRNA 可以與外源基因中的基因互補配對, 並引導Cas蛋白或蛋白複合物對外源基因片段進行剪切. 正如fig.5和fig.6所示. crRNA和Cas相關蛋白質組成的複合物是根據不同種類 CRISPR系統而不一樣的. 在最常用的type II系統中, crRNA會與noncoding trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)互補配對再與Cas9蛋白形成複合物進行DNA 剪切. 這個在後面會介紹.
Figure 5. Stage II interference.
Figure 6. schematic of interference stage.
(4) 不同的CRISPR 系統
CRISPR/Cas系統大體可以被分為兩類, Class 1 (包含了type I, III, and IV), 和Class 2(包含了type II 和type V和type VI). 在Class1 中, 對於外源基因組的剪切需要一個大的Cas蛋白複合物(由不止一種Cas蛋白組成)和引導RNA. 在Class2中, 對於外源基因的剪切只需要一個單一的剪切蛋白, 例如 TypeII中的Cas9蛋白和TypeV中的cpf1蛋白. Fig.7中清晰的表明了在何種階段, 有何種Cas相關的蛋白參與.
在人工合成Cas系統時, 最常用的是Class2 CRISPR 系統, 因為對於DNA 的剪切只需要單一的Cas9 蛋白或者cpf1 蛋白, 非常簡單便捷.
Figure 7. functional classifications of Cas proteins.
Figure 8. Genomic architectures of the known and newly identified Class 2 CRISPR-Cas systems.
Fig.8 示意了type II 中的三個subtype和Type V中CRISPR 系統的基因結構. 各中Cas蛋白的作用可以對照Fig.7去看. 其中的tracrRNA在上一節中有所介紹. 在對DNA 進行剪切的時候tracrRNA 會和CrRNA配對, 形成guided RNA引導Cas9去剪切DNA. 其中詳細的結構示意圖在Appendix2中顯示.
(5) Type II CRISPR 系統體外的合成策略和應用原理
第三章節中介紹的CRISPR作用機制是細菌體內的作用機制, 是應用CRISPR技術的基礎. CRISPR 之所以被稱為是一個強大的基因組編輯工作是因為他操作簡單, 合成也非常的便捷. 上面提到了TypeII CRISPR 系統是最常用的系統. 那麼在這一節中我就以type系統為例介紹CRISPR的應用.
首先我們先看Fig.9, 這是一個非常清晰的示意圖. 在實踐應用中, 我們會先選擇需要進行錨定剪切的基因, 基因的選擇要基於PAM 序列, 之前介紹過. 那麼type II 的PAM 序列就是NGG. 也就是說, 在目的剪切的基因上, 與剪切的基因片段後必須要有一段PAM序列, 這對後面Cas9的識別和剪切是必要的. 再選擇好欲剪切的基因片段後, crRNA則是被選擇的這一片段. 隨後tracrRNA是必須的, 因為其要和crRNA形成特殊結構後才可以引導Cas9蛋白去剪切. 由Appendix2可以看出, tracrRNA與crRNA配對的部分是repeat基因, 所以在實際應用中, 一個tracrRNA就可以和不同的crRNA (包含目的基因的protospacer和repeat序列)相配對了. 而sgRNA (single-guided RNA) 是體外人工合成的, 可以引導Cas9區剪切目的基因.
Ps: 在實際操作用, 可以不需要linker loop. (如Appendix 2 所示), 因為如果使用linker loop, 對於有每一個spacer都要轉錄一次tracrRNA. 如果一個系統中有多個spacers, 則按照Fig.8 的基因結構合成即可.
Figure 9: Schematic of artificial type II CRISPR systems
那麼當把基因剪斷了之後, 該怎麼辦呢? Cas9蛋白可以引發DNA 的雙鍵斷裂, Cas9中包含了HNH , RuvC-like 和PAM序列交流活性區. HNH 和RuvC會各切DNA 的一條鏈, 造成雙鍵斷裂. 正如Fig.10所示. 如果對HNH和RuvC活性區域進行突變使之無法行駛剪切的功能的話就會產生Dead Cas9 (dCas9). dCas9 只可以提議性的附著到特定的基因位置上 (依據sgRNA 上的序列), 而不可以行駛剪切功能. dCas9在CRISPR的各類應用中起著很重要的作用.還有一種方法就是只對HNH或RuvC的其中一個位點進行沉默突變, 形成和Cas9 nickase, 這樣就可以用兩個不同的nickase對基因組進行錨定和單鏈剪切, 造成粘性末端.
Figure 10. Schematic of main domains of Cas9 protein.
如Fig.10 所示, 單一的CRISPR系統可以造成平末端的DSB (double
stranded break), 兩個Cas9 nickase 系統可以造成粘性末端的斷裂. 當DNA 的雙鏈被剪切了之後, 有兩種修復方式: 第一種就是NHEJ, 不同源的末端修復. 這是生物體內自發的SOS修復, 緊急連接斷裂的DNA 雙鏈, 但這種連接方法是隨機的, 油價可能造成鹼基的插入, 刪除, 造成閱讀框的移碼. 而另一種是HDR, 同源定向修復, 提供一個兩端序列和斷裂序列相同的donor DNA小片段, 這個DNA小片段可以與斷裂的基因進行同源重組, 由此形成目的性的插入基因, 刪除基因等功能 (紅色標出的片段是目的插入片段). 由此可以完成基因組中基因的定向改變, 插入和刪除.Fig.10中的第三個圖則是運用了dCas9 (dead Cas9). 並在Cas9蛋白上附著上FokI 酶, 這樣兩個dead cas9 就可以實現基因的定位而不可能剪切, 而FokI 酶行駛剪切效用. 這樣的雙錨定功能會大大較低CRISPR 系統的脫靶效應 (off-target).
Figure 11. Cas9 in genomic editing.
(6) CRISPR系統的不同應用
CRISPR系統最先的用途就是造成DNA 的雙鍵斷裂, 在使用NHEJ 或者HDR的方式進行定性,目的基因的編輯. 但很快, CRISPR系統就應用到了眾多領域. 例如激活或抑制轉錄反應. 下面以Fig.12 為例做介紹. 圖A呈現了正常的Cas9蛋白和dCas9蛋白. 圖B的第一幅圖將 w subunit與dCas9 蛋白融合, 這樣Cas9蛋白可以定位到特定的位置, w subunit可以召集轉錄因子, 由此激發轉錄過程, 第二幅圖, dcas9可以結合到RNA聚合酶的下游, 阻擋聚合酶繼續轉錄從而抑制轉錄. 圖C中則同通過融合VP64去激活哺乳動物細胞的基因轉錄和通過融合KRAB去抑制轉錄. 而圖D則更為先進, 相比於圖C中只融合一個VP64激活因子來說, 這裡的方法是融合一個多肽(scFV peptide), 其中包含了VP64, 而多肽之間是可以結合的, 這樣就大大的提升了激活因子VP64的召集率, 一個dCas9蛋白最多可以召集24個VP64, 大大提升轉錄效率. CRISPR系統在轉錄的激活與抑制上還有很多應用, 這裡不詳細介紹, 有興趣的讀者可以去自行閱讀下方的參考文獻學習.
Figure 12. Engineered CRISPR interference systems and different applications.
除了轉錄的激活和抑制之外, 還可以把熒光蛋白融合到dcas9上, 這樣可以通過guide RNA 的引導去定性結合特殊的基因位點, 從而便於觀察. 這對於觀察一個目的基因的表達強度和表達歷程是非常有用的. (Fig.13)
Figure 13. Overview of CRISPR imaging. Sequence-specific enrichment of fluorescence signals by sgRNA-directed dCas9-EGFP allows the imaging of genomic elements in living cells.
微信公眾號：能量燒酒
我來給個簡單版的
貼一段我的pre稿子吧
As we all know, CRISPR-Cas9 can be used as a method to interfere CRISPR.
......
Cas9 enzymes cut DNA as scissors, so they』re called GENE scissors. Cas9 enzymes can be used to cut antigen』s DNA to eradicate viruses such as HIV. This complex can also cut nucleoid sequences that go wrong, and cell will repair it itself. This kind of gene therapy genetically cured one third cataract mice in the lab, and it』s safer than traditional gene therapy. However, it』s efficiency still awaits to be improved.
The researchers broke the Gene Scissors by making CAS9 mutate so that it would bind DNA at the same site, while it won』t cut it. Then CAS9 enzyme will stop and stop other proteins from translating, so we can use this method to close special genes. On the one hand, via this we can find the virulence genes and cure diseases like Alzheimer』s. On the other hand, Moreover, researchers used broken gene scissors to transport enzymes onto special sites on DNA, so that they could put Acetyls onto histones as Specific epigenetic marks. This will surely effect the study of cancers by ridding Genetic Markers from DNA to find the function of the markers.
......
大概說明了CRISPR--Cas9在切斷病毒DNA和進行基於它的基因療法以外的作用OAO
reference：
Le Cong et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems[J]. Science.339, 819 (2013).
Luke A. Gilbert et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation[J].Cell.2014 Oct 23;159(3):647-61.不足之處敬請原諒呀，小女子才疏學淺推薦閱讀：
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