「生物正交化學」是一個什麼領域？在做哪些研究？

01-06

2015 湯森路透引文桂冠：

美國斯坦福大學化學與系統生物學及放射學教授卡洛琳·貝爾托茲：
開拓生物正交化學（bioorthogonal chemistry）領域，使研究者得以在不干擾生物系統的情況下觀察生物體內的生物化學反應，從而一窺與包括癌症在內的多種疾病相關的細胞過程。

如何理解「生物正交化學（bioorthogonal chemistry）」這一領域？
在不干擾生物系統的情況下觀察生物體內的生物化學反應是如何實現的？
目前的研究是怎樣的？

磨破了嘴皮去解釋，還不如看圖說話：

（圖片來源：Carolyn R. Bertozzi et al., Copper-free click chemistry in living animals, PNAS, 2010, 5, 1821-1826. ）

上面這個圖裡的SiaNAz是細胞表面的一種糖，比如說我們想要研究這個糖在體內是怎麼轉化的，以及這個糖在細胞表面是怎麼分布的，就得想辦法先標記它讓它現形。生物正交化學便是其中的一種好辦法。具體操作是，我們知道Ac4ManNAz可以在體內被轉化成SiaNAz, 於是我們給前者加一個小小的後綴（也就是那個N3，疊氮基團），這個後綴足夠小，不影響前者在體內被轉化成後者。然後再另注射那個有FLAG標記的分子，這個分子有一個能和N3基團反應的基團（炔基），於是當FLAG標記的分子遊走到SiaNAz分子附近的時候，Duang, 它們就結合在一起了。FLAG這個標記也就被添加到了這個糖分子上。於是你就知道SiaNAz這個分子在哪些組織和器官中分布多少等諸如此類的問題了。

之所以叫生物正交化學，正交的意思是說，這兩個分子上做的化學修飾（經過精心設計）都不影響各自在體內的代謝，也不和其他分子結合，所以分別注射這兩種分子，它們也只會和對方反應結合。當然還有一些別的要求，比如反應的速度要足夠快，這樣才能讓標記物（上文中的FLAG）在你想要標記的分子被代謝前就能找到它並與之「緊密結合」。

生物正交化學有啥用？為什麼不能先體外標記，再注射？有時候可以，但更多的時候，標記過的分子沒辦法在體內被轉化，甚至不能被細胞正常接納，這樣的話，也就無法研究某個分子在生物體內的轉化和代謝。生物正交化學把標記物和標記對象分開注射，標記物不會干擾標記對象的轉化和代謝，為研究一些用「先標記再注射」無法研究的分子提供了新的思路。

（為什麼知乎會有這麼難的問題？去年講這篇文獻的時候看了三遍才看懂什麼是「生物正交化學」）

講一下我對生物正交化學的理解。

生命系統是由相互交織作用的生物大分子，代謝產物，各種離子組成的。那麼具體某一種物質在系統中的作用是什麼，有時候只能在生命系統中去觀察。如果把它分離純化出來，一則它可能不能發揮作用，或者發揮的並不一定是其在體內原來位置所應有的作用。

比方說，小紅是生物科學家，如果把她單獨關在一個空房間里，斷絕她與外界的聯繫，只是供給食物飲水。沒有設備，不能與同行交流，她就不能繼續做生物研究了。再比方說，戰爭期間，我們發現小明在後勤部隊做廚師。但其實他在和平時期是化學工作者，去做飯是形勢所迫。

所以「使研究者得以在不干擾生物系統的情況下觀察生物體內的生物化學反應」非常重要。綠色熒光蛋白（2008年化學獎）是一種方法。但也有體積較大，只能對蛋白進行標記等缺陷。而生物正交化學，也可以應用於此（但不僅於此）。

所謂「正交」其實是有互不干涉的意思。生物正交化學（反應），我們「微言大義」地解釋一下就體現為：首先它得是一個（比較像樣的）化學反應。產物要比較單一，進行的要比較徹底，速率不能太慢。進行得太慢，底物被代謝掉的也會更多（一個反應做半年才能知道結果就更難畢業了是不是...)。其次，它要與生命系統盡量地不互相影響。它的底物，產物，催化劑，要低毒（盡量小，盡量和其他物質沒有物理、化學的作用），以及反應條件應該是生命系統能承受的（高溫高壓，高濃度金屬催化都是不行的）。

所以生物正交反應應該是選擇性非常好的，是速率常數比較大的。

Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974 – 6998

ACS Chem. Biol. 2014, 9, 16?20

有了這樣的反應，我們就可以把其中一個底物（反應基團）連接到生命系統中某個特定的生物大分子上，由於它小且低毒，我們估計整個系統並沒有受到大的影響。我們再把連有另一個底物（反應基團）的報告分子（比如熒光分子）加入體系。雖然濃度會比較低，但專一快速的生物正交反應也能進行，這樣就完成了對特定分子的體內標記。

本人非生物學內行，也沒做過真正意義的生物正交反應。我想從化學角度講兩句我的看法。

In vivo 層次上的生物正交反應，首先底物就應該是「生物正交」的。Staudinger ligation 里的疊氮和三價磷，疊氮炔烴環化（最為人所知的click反應的一種）以及其他的環加成反應中的各種富電子、缺電子體，過渡金屬催化反應中的各種底物，都是在生物體中很少見，或者沒有的。其次反應的機理也是「生物正交」的，周環反應，過渡金屬催化，在生物體重也非常少見。很難想像普通的極化反應或自由基反應可以不被打擾地再生物體內進行。所以我覺得對於新的生物正交反應的發現，將會隨著新的底物（十五族現在用的比較多，那麼相鄰的十三，十四，十六族會不會有更多的發現？）的應用，新的反應機理（更加高效，特異的環化反應，與過渡金屬催化反應）的發現，而增多。

標記只是生物正交化學的一種用途，生物正交化學只是化學生物學的一部分。這一領域應該還是會大有作為。至於今年會不會得諾獎，就很難講了...但我覺得這一領域早晚會有諾獎出現。歡迎討論。

謝@張之詩邀，很抱歉隔了兩天才來回答。主要是因為對這個領域僅略知一二，怕回答不好，遂在被邀請後回去補了些功課。希望自己的回答能夠對題主有所幫助。以下正文：

初中時政治老師教我們認識世界應該本著：「是什麼，為什麼，怎麼辦」的螺旋上升式思維。這裡也用下這個模式來組織下答案。

首先，生物正交化學（bioorthogonal chemistry）是什麼？

維基百科上的定義：The term bioorthogonal chemistry refers to any chemical reaction that can occur inside of living systems without interfering with native biochemical processes.

簡單翻譯下：生物正交化學指的是在活體生命系統內部能夠發生的並且不影響本身生物化學過程的化學反應。

來自Jennifer A Prescher Carolyn R Bertozzi在2005年NCB（Nature Chemical Biology）的綜述里他們給的定義：In recent years, an alternative tool for tagging biomolecules has emerged from the chemical biology community—the bioorthogonal chemical http://reporter.In a prototypical experiment, a unique chemical motif, often as small as a single functional group, is incorporated into the target biomolecule using the cell』s own biosynthetic machinery.

簡單翻譯下：近年來，在化學生物學領域，一種新的標記生物分子的方法出現了-即生物正交化學報告系統。一個典型的生物正交化學的實驗，指的是：一個特殊的化學元件，一般是小的、簡單的功能基團（後面將會提到，像是磷酸基團、疊氮基團等等），利用活體生命系統（如細胞或者完整生物體）自身的生物合成方式整合到目標生物分子上的過程。

綜合二者給的定義，我們可以知道，生物正交化學是一個新興的活體生物標記-報告方法，其主要方式是利用活體生命系統的生物合成系統將特定的化學分子小基團整合到目的生物分子上。

接下來，科學家們為什麼要發明並發展這一方法？

一般發展新方法的動力一般都是舊的方法不好用，即存在缺陷。生物標記在生物學進程研究中的重要性以及其具有的優越性應該不需要贅述了，這裡讓我們回顧下此前我們常用的生物標記方式有哪些。

最早在生物化學研究中運用標記物（示蹤物，Tracer）的科學家可能是研究脂肪酸分解代謝的Knoop。以下文本來自生物化學，王鏡岩朱聖庚徐長法，第三版下冊234頁，略修改。「Knoop在1904年運用苯基作為示蹤物來標記脂肪酸分子的末端甲基，並用標記好的脂肪酸喂狗，通過分析狗排出的尿液來監測脂肪酸在體內的分解代謝方式。」

隨著生物化學學科的發展，陸續出現了如：同位素標記（核酸蛋白都有廣泛運用，由於其對人體的危害性已經很少用了）、熒光蛋白標記（主要在蛋白層面運用）、單分子標記熒光失蹤法（華裔科學家莊小威的研究領域，可以在多種生物大分子上運用，如今仍是研究熱門）等等。其中最廣泛運用的是熒光蛋白標記法。

回顧這些推動生物學發展的生物標記方法，可以發現普遍存在的一個問題是，標記物對被標記的生物分子產生的結構、功能上的影響（structural perturbation）。特別是熒光蛋白標記，由於熒光蛋白分子量在26kDa（千道爾頓）左右，對蛋白三維構象的影響很大。由於功能是在結構的動態變化中體現的，在結構已經變化的前提下去探究分子的功能，準確性就會打些折扣。

除了對生物分子結構上的影響，傳統的生物標記方式還有著其它的局限性，諸如：標記方式多是體外構建質粒，之後轉進活細胞或者生物體使之表達；標記的結果需要使用激發熒光，或者放射顯影的方式來獲取；同時熒光蛋白無法標記如糖類、脂質等非基因編碼的生物分子。

故而一種輕便好用而又能高度還原生物體內生物學過程的生物化學標記方式就應運而生。以化學小分子作為生物標記物最大的好處就是它們擁有更高的進入細胞以及外周血能力（相對於熒光蛋白標記而言），以及具備高選擇性。

在得知生物正交化學有這些好處之後，具體該如何實施一個完整的生物正交化學實驗呢（怎麼辦）？

首先讓我們看看Carolyn R Bertozzi文章中所提到的策略：

主要分兩步，第一步生物標記，即利用能夠被體內生化過程利用的特定小分子特異性靶向整合到目標生物大分子上；第二步化學標記（報告，一般是熒光或者顯色等），即利用能夠與第一步中的小分子特異性結合的化學發光基團在一定的條件（不影響活細胞狀態）下與小分子結合或者反應，報告體內被標記的大分子的實時狀態。

這裡分別討論兩個步驟中的操作要點。第一步生物標記中的小分子以及標記靶點的選擇非常關鍵（個人認為是正生物正交化學的限速步驟），為了能夠被生物體內已有的生化反應過程所利用且不能影響反應過程，一般選用生物大分子的組成成分的小基團，比如蛋白質中的氨基酸上的氨基、糖類分子上的酮基（醛基）、脂質分子上的羧基、核酸分子上的磷酸基團等，能夠被體內如肽鍵合成、氧化還原、親核加成等反應所結合上，是比較理想的選擇。基於這樣的理念，目前在實驗中得到應用的小分子主要有以下幾種。

表格來自Jennifer A Prescher Carolyn R Bertozzi發表在2005年NCB（Nature Chemical Biology）的綜述。

在選好小分子以及要標記的生物大分子之後，針對不同小分子的化學標記物（報告物）也就差不多定下來了。接下來就是如何優化條件讓小分子更好地結合在生物大分子上，同時減少背景；優化條件進行實時監測，同時保持生命系統的正常運轉。先休息下，過兩天繼續，這幾天還有幾篇文章要改，還要做實驗，抱歉。希望題主還有大家有所受用，有不同意見的歡迎在評論里提出，一起學習進步。關於參考文獻會在全文結束後一起貼在文後。同時，強調，未經許可，嚴禁轉載！

閑逛的時候發現很久之前看過的這個問題......雖然沒有做過相關的東西，不過基於自己近期的了解來交流一下，也是回顧一下這一領域2016年的一些發展。

這個東西剛出來的時候答主也是吃了一大發安利，感覺從此生物正交化學就要走入千家萬戶。不過就目前看來，似乎進展還是很緩慢，感覺要從方法學研究演化到到商業化試劑還有很長的路要走。

生物正交化學有一個很大的問題。雖然click-chemistry可以避免跟生物體內的東西反應（正交），但是反過來你要給活體內感興趣的生物分子（比如說朊）帶上一個click-chemistry的標記也是一件困難的事情，這大大限制了生物正交化學的應用能力，像從一開始Bertozzi等人的研究只是用於糖化學顯像的方法，而很難拓展到其它領域。而生化界所關心的內容大多還是在於朊和核酸，所以如果生物正交方法只局限於糖化學，未免有些邊緣化，所以發展更加普適的生物正交化學方法是一個趨勢。

有一種流行的方法是劫持朊合成機制，用改造過的氨醯tRNA和劫持的密碼子把帶click基團的氨基酸整合到朊中，然後再用click-chemistry『特異性』地對感興趣的朊進行反應。這種方法看起來『很正交』，但其實是『偽正交』。因為在生物體內有一部分其它的朊序列上也是帶有你劫持的密碼子的，這樣帶有click基團的氨基酸就會被接到你所不感興趣的蛋白質上，這樣click反應就不是特異的。在去年發表的一篇文章中探討了使用click-chemistry的方法來進行"無標籤"的朊富集研究，不過因為這個問題的存在所以control的背景比較複雜。（Click-MS: Tagless Protein Enrichment Using Bioorthogonal Chemistry for Quantitative Proteomics）

如果考慮到對核酸的研究，現在一般的DNA合成公司都有提供click-chemistry的基團合成服務，但是究竟怎麼用並不清楚，可能只是用來做一些fancy而無用的實驗罷了（滑稽）。在去年robert kingston發表的一篇文章則是在培養基中混入ethynyl-labeled nucleic acids，在基因組複製的過程中把帶click基團的核苷酸混入到細胞基因組中，然後進行全細胞click反應，以此來達到富集全細胞染色質的目的，不知道這一方法在染色質化學領域應用前景如何。（Current Protocols in Molecular Biology）P.S. 如果對劫持朊合成通路的方法感興趣（想嘗試一下的話），也許可以閱讀一下這篇綜述。（http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cr400355w）

感謝　 @張之詩　的邀請。

前面人講了這個生物正交標記反應是什麼回事，我看了下最近這方面的工作，在５到１０年之後這個東西才會有得獎的可能（因為標記方法是得獎的一個熱門）。一是因為現在這些方法都是概念上的驗證，是concept proof的工作,二是這個工作沒有很廣泛地應用於實驗室的日常。

國內也有幾個人做的，北大化學的陳鵬，陳興，浙大生科院的易文，算是比較新的領域

不請自來。

恰好也在組裡面專門講過carolyn大神的文章。關於這個反應的大致機理前面童鞋講的很清楚了，說說這個領域目前的問題和可能的發展方向。

問題就是所謂的修飾過的糖在實際代謝過程中表達的效率不高，導致標記強度不夠，而且可能存在潛在的毒性(未知）。

目前的工作，一方面，發現新的生物正交反應，利用點擊化學的高效性試圖在生物體內做文章。另一方面，通過對細胞代謝通路和細胞表面多糖的深入了解，讓被修飾過的糖更高效的表達。

不過似乎無論做啥，都是為了carolyn得諾獎鋪路，畢竟人家先提出這個概念。

手機黨頭一次碼這麼長答案，好辛苦……嚶嚶

生物正交化學反應(bioorthogonal ligation)正日益成為在活體內對生物大分子以及活性小分子進行特異標記的一種有效方法。基於生物正交反應的標記, 需要在目標分子中引入特定的化學報告基團(chemical reporter), 然後通過生物正交反應與含有互補基團的探針進行反應, 從而實現對目標分子的特異標記。但是該方法面臨著很大的挑戰，因為它需要相應的化學反應在生理條件下具有很強的活性，選擇性，以及對周圍其他活性分子保持良好的惰性。迄今為止只有少數的幾個反應可以滿足這些條件並被應用在生物醫學研究中，其中包括由Bertozzi等人發展的Staudinger Ligation，由Sharpless 等人開發的一價銅離子催化的疊氮與炔基的環加成反應(Azide-Alkyne Cycloaddition, AAC)，以及由Bertozzi等人進一步發展的不用銅催化疊氮與炔基的環加成反應(Cu-free Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition, SPAAC).這些反應也是我們通常所說的「點擊」化學反應(「Click」Chemistry)。

就是對活體組織做electron microscopy？還是fluororescence microscopy？bertozzi 今年去stanford了。。。我是她樓下的組的，做bioconjugation。。。不太了解。我今年看好Doudna

更新，基本原理查了維基。。。蛋痛啊。。。其實自己組也在做一些類似的工作。

基本原理是首先chemically engineer一個metabolic的重要中間物或者是蛋白質（functional molecule）

之後再進行和bioconjugation不同的，最關鍵的一步，bioorthogonal ligation。注意是ligation。

這樣子ligate一個fluorophore或者affinity probe 上去。這個ligation並不影響原有的蛋白質或者中間產物的反應能力和性質（所以是orthonormal）然後就可以通過probe直接觀察反應了。

我在的組做的主要是bioconjugation。。。我們雖然用的有些化學方法是類似的。。。不過不保證生物分子的性質不改變。。。我們是希望做出一些不同性質的。

化學小白。。。認識在bertozzi組的大牛已經去西北和一堆神校了。。。如果有說的不對的。。。諸位大牛請指摘賜教

乙未年八月十五

咦居然被邀答這個問題了 @你是個個……其實這個問題剛提的時候我就看到了，我們樓上就是bertozzi的學生陳興老師的實驗室，原來的舍友又去不鋒利教授實驗室做博後了，真心不好意思班門弄斧。

所以我就八卦一個吧，bertozzi是個les嗯

求摺疊

生物正交化學就是在生物體內做反應，且反應與生物體互不影響。

反應高效無毒專一性好常溫常壓水相體系耐鹽生物體天然狀態下不存在基團的反應

簡單來講，就是想在生物體內實現特異性的反應，讓我們想研究的蛋白等標記上熒光分子等。進而對我們感興趣的蛋白等進行監測，研究。

基於「點擊化學」的化學生物學：熒光成像+亞細胞器定位+靶蛋白垂釣？