韓春雨團隊在《Nature Biotech》上發表的 NgAgo 基因編輯技術是什麼？有何突破？

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想了解一下目前基因編輯的手段，以及這項技術的優勢。
我院教師韓春雨在Nature系列頂尖期刊《Nature Biotechnology》發表重大研究成果

對於生物學技術，要針對科研和應用需求，深入了解細節再進行判斷，不能人云亦云。同意 @Yang Liu 的謹慎態度，部分同意 @孟浩巍的樂觀分析。

NgAgo的缺點其實是很明顯的：只能切割具有負超螺旋構象的DNA（SC DNA，比如質粒），對於線性化雙鏈DNA和ssDNA是沒有切割活性的。這說明：一，NgAgo無法用於dsDNA和ssDNA在體外溫和環境下的編輯處理，因此很難用於開發相關的體外分子生物學工具，這比起Cas9是一大劣勢；二，在分裂生長不迅速的細胞中，基因組DNA的SC DNA比例不高，因此NgAgo很有可能也無法進行有效編輯。此外，在生物醫療應用中，向人類細胞中導入外源DNA是很忌諱的，CRISPR-Cas9-sgRNA complex導入人體細胞後不會在細胞中長期存在，而NgAgo的gDNA導入細胞後可能會被整合到基因組上，進而帶來ethic issue，這一點也是不能忽略的。

至於為什麼NgAgo及其之前發現的homolog只能切割ssDNA和SC DNA，原因很可能正是NgAgo沒有PAM序列依賴性。從前些時候發表的CRISPR-Cas9的單分子觀測可以知道，PAM對於Cas9的作用可不單是位點識別，更重要的是gRNA與DNA的結合起始處；也就是說，PAM處先打開一小段，讓gRNA的seed sequence做strand invasion，然後整條gRNA才能達成對於target sequence中DNA雙鏈的打開和替換，整個過程相當於通過PAM實現了一個動力學上進行快速target binding的路徑；換言之，PAM的依賴性是Cas9在editing feasibility和target binding kinetics之間進行妥協平衡的結果。NgAgo沒有PAM依賴性，而文章Supplementary Fig. 3也表明NgAgo確實無法切割線性化的DNA，但對於雙螺旋結構不穩定的SC DNA和沒有雙螺旋結構的ssDNA，NgAgo卻具有正常切割活性，這些結果強烈地暗示，沒有PAM的代價就是NgAgo無法單靠自己的力量打開正常dsDNA的雙鏈結構。

我們再看看能夠切割DNA的bacterial argonaute的來源，都是極端嗜熱古生菌和極端嗜鹽古生菌。嗜熱古生菌的生存溫度通常在60攝氏度以上，這種溫度下DNA雙鏈結構本身就不穩定（類似於我們做PCR的環境）。NgAgo來源於極端嗜鹽古生菌，我將其蛋白質序列用於NCBI non-redundant protein database的檢索，得到BLAST結果的前十都是極端嗜鹽古生菌，其基因組的GC含量均在60%以上。以前的生化知識告訴我們，當DNA的GC含量較高，且位於高鹽濃度環境中時，DNA的負超螺旋比例會顯著提高；因此這些基因組GC含量高的極端嗜鹽古生菌的基因組DNA很可能存在著大比例的負超螺旋。這就解釋了為什麼DNA-editing bacterial argonaute的來源不是極端嗜熱古生菌就是嗜鹽古生菌——只有在這兩種菌的生存條件下，bacterial argonaute才能有效執行DNA editing的功能。

我們回過頭來看NgAgo的優點，有三點。第一，NgAgo和gDNA轉染哺乳動物細胞的實驗方法，特別是在multiplexed editing方面，應該會比CRISPR-Cas9簡化很多，畢竟gDNA只需要合成拿到手裡就可以轉染，不必再像CRISPR-Cas9一樣需要特殊的載體或者犧牲轉染效率. 第二，NgAgo畢竟擺脫了PAM的限制，對於一些DNA特殊序列的editing應該會特別有用，比如AT-rich的基因組複製起始位點。第三，前人的實驗表明CRISPR-Cas9在哺乳動物細胞中很容易被內源RNA干擾，而NgAgo由於只能結合ssDNA，所以內源RNA的干擾是可以忽略的，這也暗示了NgAgo對於負超螺旋程度不高的細胞基因組DNA切割能力應該不如Cas9但體現出來的效率卻與後者相差無幾的原因。

總體來說這是一個創新性極強，應用前景尚且不明朗的工作；NgAgo的優劣勢在行內人看來是很明顯的，如何根據具體的生物工程和科研場景來使用好這個新的合成生物學工具，是未來生物科研界的一個值得追蹤的有趣問題。

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最後結尾多說兩句。NgAgo作為合成生物學的新工具，其發掘過程所依賴的bioinformatics技術並沒有什麼特別之處，僅僅是生物科研日常使用的NCBI資料庫；但其所依賴的思路非常可貴。TtAgo可以切割DNA，但必須需要高溫→尋找帶有TtAgo homolog但生存溫度溫和的細菌→挖掘出NgAgo，這一思路正印證了可能是20世紀最偉大的生物進化與遺傳學家Theodosius Dobzhansky曾說過的話，"Nothing in Biology Makes Sense Except in the Light of Evolution"。在我看來，生物實驗室里大多數搬磚的人以及監督別人搬磚的人，早已沉溺在搬磚的細節而忘記了這句話的含義。

我的導師歐陽頎院士曾說，需要複雜統計方法才能得到的相關性就不是相關性。這句話對應到合成生物學的元件發掘過程就可以表述為，合成生物學的元件發掘不需要太高深的bioinformatics，關鍵還是指導發掘的思想。每次看到國內外有人用自己的bioinformatic algorithm多高深多複雜來證明自己的元件好，合成生物學做得好，我的內心都是平靜的。

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真心希望越來越多工作在北清浙復交之外高校的年輕老師們做出這樣創新性極強的工作。我們的高校科學資金目前還絕大部分集中在北清浙復交這幾所學校里；韓春雨能在艱難的科研環境和窘迫的資金支持下做出這樣的工作，實為難能可貴。這也提醒科技部領導們，科研資源不能僅僅集中在北清浙復交這幾所學校，我們這個國家裡，有科研追求的年輕一輩，還多得很吶。

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多謝@夏小迪指正我關於NgAgo是否能夠切割ssDNA方面的錯誤；我之前誤以為是能切的。

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上述一切討論的前提是數據真實、結論可信。從目前自然雜誌出版集團、河北科大與國內科研界三方面的溝通來看，韓春雨在此論文中學術不端的可能性極大。希望大家閱讀此文的時候注意這一點。學術界進行論文評閱時採用的是同行評審制度，即在預設論文沒有學術不端的前提下邀請同行對論文進行匿名評審；這種疑罪從無的預設也是現代工業和消費社會得以順利運行的前提，就像我們在飯館吃飯時不會預設老闆投毒，在過馬路時不會預設司機不遵守交通規則一樣。因此，我們對於學術不端要採取零容忍態度，維護社會信任。

另外，即使韓春雨涉嫌了學術不端，我仍然還是堅持「國內科研終歸還是需要靠年輕人」的觀點，因為這不是靠某個孤例支撐的論斷，而是在當前被反覆驗證的事實。

謝邀。

在另外一個類似的問題下已經被邀請一次了，我就一樣答。

簡單來說，這項成果進一步研究了ssDNA介導的Argonaute作為一種雙鏈DNA內切酶即基因編輯工具的應用價值，獲得了一系列喜人的發現。主要貢獻是找到了可以在低溫條件下發揮作用的ssDNA依賴性Ago蛋白。

為了準確介紹這項成果，我仔細閱讀了文章原文和相關報道。發現網上存在不少有失準確性的答案，我在下面的回答中盡量認真引用文章細節來介紹。

這項成果本身很有價值，而且好事多磨，經過切磋琢磨做得質量很高，這種做研究的態度值得在當下這個氛圍中大書特書。當然是不是像有些人說的目前就已經「劃時代的技術打臉CRISPR」，打破「美國技術壟斷」（雖然Addgene上隨便買其實也沒有進張峰的腰包），雖然可以理解有很多充滿情懷的言論，但是單純從學術角度而言，NgAgo是否足以媲美CRISPR，言之尚早。

目前來看這個研究成果是否有更大前景還要觀望。我想大部分關注CRISPR的朋友應該都還對2014年那篇DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute有一些印象，其實那時很多人的態度也是再觀望一下，我記得當初實驗室里做CRISPR的review報告的時候還提了一下說現在發現DNA也可以介導定點內切了。現在經過兩年觀望，我們觀望出了這樣一項成果，可以說很欣喜的是它在往好的方向發展，希望能夠保持這種勢頭。

一項DNA編輯技術是否有優勢涉及到方方面面。從目前的情況來看，NgAgo的優勢很明顯，主要體現在：

1）反應效率不低（不說高，但不低）

2）特異性較好（但有人引用說因為gDNA比Cas9的gRNA 長5nt，所以精確度提高1024倍，這個「理論上」的4^5不得不說是噱頭，因為基因編輯的精度或脫靶率不是這個意思，這樣外行的計算是不應該的）

3）不依賴PAM

4）NgAgo本身分子量不大

另外還有一些文章中作為優勢，但也可能是劣勢的性質（比如使用ssDNA介導，提高特異性同時會帶來很多問題）不論如何優勢是明顯的，但是僅僅這些方面並不夠，還需要研究更多問題，比如特異性好是有限實驗基礎上的理論結論，實際應用脫靶率如何要看具體情況。

目前來看有幾項事關這項技術未來的、優先待驗證的問題是：

1）系統正交性（與細胞內原有生物系統發生相互干擾的程度）

2）多位點編輯能力

3）NgAgo蛋白的模塊化程度（NgAgo本身被工程化改造的潛力）

4）ssDNA的通用性和缺點

不要小看上述問題，條條都是卡脖子的，一條不給力就會被CRISPR比下去。

很多人知道CRISPR很火，也知道CRISPR是很好的基因組編輯工具，容易以為基因編輯工具本身是很牛的，實際上CRISPR之所以火，還有很大一部分原因在於高正交性、高通用性、高工程化潛力帶來的廣泛應用，諸如轉錄後調控、人工TF等等。核酸定點內切是一個基礎性質，帶來了上述性質的可能性，需要經過驗證才能就是否可以作為CRISPR的替代技術有一個結論。

比如在不同物種細胞系統中的正交性如何？目前知道Ago在真核到原核細胞中廣泛存在同源基因，這個在文章中是作為某種優勢來講的，但實際上可能是一個劣勢。因為正交性問題，在人類細胞中好用未必在其它物種平台中好用。大家可能注意到了，文章開篇第二個實驗就是做了一個簡單的正交性測試，測試結果還不錯，文中提到

which implies that there is very limited 5 ′ phosphorylated ssDNA present in human cells, suggesting that endogenous ssDNAs will not mislead NgAgo to off-target sites

這當然不足以說明NgAgo具有高正交性，作者也用了implies的措辭，還有待進一步證實。可以從文中看出，作者最擔心的問題其實也是系統正交性，在文章最後，作者特意強調需要進一步的高通量實驗來研究這個問題，可見作者並非沒有意識到，而是受限於時間或其它科研條件。

除此之外，多位點編輯能力是CRISPR的一項重大優勢。我們現在知道NgAgo和ssDNA的結合是非常穩定的（在37℃條件下不可逆），這當然是某種提高特異性的優勢，但穩定也是雙刃劍，有可能成為劣勢。文中提到：

similar to mammalian Ago2, which cannot exchange its bound oligos with free oligos at 37 °C

這樣的性質是否會影響到NgAgo在多位點編輯中的反應效率不得而知。我看到大部分評論都沒有提到這個問題。

CRISPR還有一個亮點是Cas9的模塊化性質。可以容許進行較多的蛋白工程改造，NgAgo是否有這樣的高度模塊化的性質也將直接決定這項技術能否問鼎優秀DNA編輯技術的地位。如果對蛋白質工程設計的可擴展性不好，那麼其應用很有可能受限。

最後還有ssDNA在各種細胞平台中如何使用等問題，我們現在知道CRISPR系統常導入gRNA或通過sgRNA transcription vector來製造介導核酸，DNA顯然不能用這招，直接導入DNA本身就限制了NgAgo在一大類物種當中的應用潛力。有同學展望天然的5"p-ssDNA的加工機制未來可以利用，然而文章中提到人類細胞中5"p-ssDNA並不豐富。這有利於系統正交性，卻也暗示ssDNA的使用有可能成為這項技術的一個瓶頸。有一位答主說ssDNA的用量只要CRISPR技術中RNA用量的1/10，這顯然是英文不好造成了誤讀，文章中原文是：

if the sgRNA is expressed from a plasmid and the normal dosage of an ssDNA guide is only ~1/10 of that of a sgRNA expression plasmid

可見，特異性ssDNA在這項實驗中是可以通過使用濃度飽和來增強NgAgo的特異性的（與破壞正交性的ssDNA競爭性結合NgAgo），但是這個robustness是一柄雙刃劍。DNA分子本身的穩定性、系統的魯棒性和使用方式會影響這個系統的可控性。一旦系統可控性不好，基本上會被最重要的生物醫療領域排除在外。這個問題 @張浩千闡述得比我高得多，值得學習。從合成生物學角度看，如果出現這樣的問題，ssDNA帶來的高特異性可能是得不償失的。

還有一個有趣的點，就是NgAgo存在隨機移除切點附近核酸的性質，這樣的性質能不能通過酶工程加以優化，這些都需要進一步研究。

（Figure from Feng Gao, Xiao Z Shen, Feng Jiang, Yongqiang Wu, Chunyu Han）

上述問題都是NgAgo成為一項優秀基因編輯技術道路上仍需接受的考驗。希望未來可以一路順利。

我覺得韓春雨老師有一個想法是對的，就是一旦發表，有興趣的實驗室會很快跟進去做這些工作。國際上一些合成生物學實驗室資源極優，競爭力很強，所以無論這個低溫NgAgo蛋白潛力如何，很快就會有結論。不必著急，是金子總會發光。

P.S. 很多人說這個成果沒上Science是學術壁壘，是Science瞎眼。有可能，國際學術壁壘黑幕還是很多的，但也不盡然。因為從上面的分析來看，它還有很多不確定性，除了優勢外還有很多尚不確定能達到CRISPR同等能力的方面。當初投稿Science的時候，據《知識分子》報導，可能實驗並沒有現在全。如果在2012年，那麼它無疑可以上Science，但是在全球對CRISPR都已經有深刻認識的今天，新的基因編輯技術必然面臨更高的要求。

需要指出的是，之所以我認為該文章最大的貢獻是找到了ssDNA介導的低溫Ago，而不是發明了這項技術，或像一部分人以為是「創新」使用DNA介導基因編輯，是因為用ssDNA介導Ago蛋白作為DNA編輯工具由來已久，7年前，University of Freiburg iGEM-2009已經有本科生團隊做過類似的工作（下圖）。自從CRISPR升溫以來，DNA介導基因編輯始終在發展，在合成生物學領域並不是一個陌生的話題。

（Figure from Team:Freiburg bioware/Project - 2009.igem.org）

目前為止的一個重大意義恐怕在於它是在研究條件相當一般的實驗室中實現的，這是很值得重視的一件事。再次拷問了我國的科研經費分配體系。有的大幾百萬的項目給某個海鮮搞個全基因組圖譜搞個文庫什麼的（不是說分子育種不重要不該花錢，而是說一些創新度更高的研究分不到錢）。國內還有一些合成生物學研究卻無法擺脫傳統基因工程的影子，用合成生物學的瓶子裝基因工程的酒，這是非常遺憾的。

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528更新，今天早上我的微信里是這樣的（下圖）。

韓老師在北京大學的報告中以數張PPT引用了本答案的內容，我想知乎現在的影響力要比我想像得大。很遺憾因為我人不在北京，只能通過北大有出席的朋友了解韓老師對於這些評價的看法和回應。當然希望未來有機會，可以和韓老師當面交流。

110報警贊，來一波更新：

毫無疑問NgAgo近期在國內會被很多人跟進，最近已經遇到不少人來聊想重複NgAgo，把這個技術用在XXX，XXX和XXX裡面。一系列深入探討加深了我對這個技術的認識，所以更新一兩點新的想法。

首先只有國內的同行們不大面積坑隊友，NgAgo這個方嚮應該應該很快會炒熱的。

但是NgAgo未來和CRISPR-Cas9（或者Cpf1）在基礎科學的應用上，應該走的是完全不同兩個路子。兩者最大的區別在於guide的不同，一個使用DNA，一個使用RNA，將決定兩種使用策略。而其他的差異並不是決定性的。

NgAgo使用ssDNA，因此在單個genome editing上要比用CRISPR-Cas9方便一點。CRISPR-Cas9使用RNA，不管是轉染質粒也好，體外翻譯也好，都需要相對繁瑣的前期準備。而ssDNA從公司買回來就立即可用。因此高通量的工作可能是一個非常好的應用方向，如High-throughput library construction，NtAgo的系統會比Cas9時間成本和金錢成本都低。多位點編輯可能會有優勢，有待檢驗。

NgAgo是外源注射一波流的，這一波很強，但是這波過去了，也就做不了啥了。

之前已經討論過了靠內源表達guide的可能性基本為0。所以你不能指望像Cas9一樣，把要用的guide RNA和Cas9以及其他組建都先裝到基因組上，做可誘導的編輯甚至發育過程的預編程，比如像這篇在斑馬魚里的工作：A CRISPR/Cas9 Vector System for Tissue-Specific Gene Disruption in Zebrafish，Development Cell 2015；可以在發育過程中，在特定組織內進行編程。以及複雜的編程調控如epigenetic editing，NgAgo也很難靈活地實現。

至於臨床應用，大家向來都是非常實用主義的，對於特定位點的單基因突變治療哪個效率最高安全性最好用哪個，很多時候TALEN要比這些新技術效果好。我2014年還聽到過一個UC Berkeley在申請的專利，和進入一期臨床的HIV治療方案，使用的甚至最老的ZFN（zinc-finger nuclease）的技術。所以實際上還沒有誰替代誰的問題，只是多種選擇。不過NgAgo因為ssDNA潛在的免疫應答的問題可能會局限於受精卵的基因編輯而非成體的基因治療。

---原答案分割線---

謝邀，把我這個常年潛水黨給炸出了真是誠惶誠恐。

歐洲時間大早上的時候就被刷屏了，所以我第一時間就把原文和最近相關的幾篇文章看了遍。

詳細的關於文章和課題組的介紹可以移步知識分子韓春雨：「一鳴驚人」的中國科學家發明世界一流新技術 | 特稿 - 知識分子 - 知乎專欄。

我以下做一些簡單的介紹，並針對性和這幾年比較火熱的CRISPR做些比較。

我個人的觀點是個極具潛力的新技術，但是無法全面替代CRISPR。而且這篇文章實際上是Ago Genome editing的復興。

1. 什麼是Argonaute（Ago）？

Argonaute在真核細胞中被熟知參與RNA沉默，組裝成複合物對靶點mRNA進行切割從而實現沉默，並被認為來自對RNA病毒的免疫機制。前人工作發現Argonaute在很多原核生物中的確會參與對病毒的「獲得性免疫」，而且不但可以針對外源性RNA還可以切外源性DNA。

2. 什麼是NgAgo？

這篇文章找到NgAgo是來自古細菌中的一種嗜鹽菌Natronobacterium gregoryi的Argonaute蛋白。NgAgo結合24鹼基長度左右的單鏈DNA（ssDNA），並由這段guide-DNA介導，切割具有相同/互補序列的雙鏈DNA。

3. 這篇文章的主要貢獻是什麼？

文章最大的貢獻是找到一個可以在常溫下工作的使用ssDNA做guide的Ago同源蛋白，並證明是在人類細胞內NgAgo可以可編程地定點切割雙鏈DNA從而實現基因組編輯。

而之前所有報道文獻中的Ago同源蛋白都有各種問題以至於不能應用在人類基因組編輯中：多數來源於嗜熱菌（van der Oost Lab的2014 Nature 【2】和2015 NAR文章【3】，Doudna Lab 2015 PNAS文章【4】），因此需要較高溫度的工作環境或熱激活（60-100℃）；Alexei A.

Aravin 2013 Mol Cell 文章【5】是一個比較複雜的機制，可以結合ssRNA定點切質粒，結合ssDNA定點切RNA，不實用，容易受到背景ssRNA的干擾。實際上除了已經發了不錯的文章的這些工作，Ago作為Genome editing並不是一個全新的概念，很早就有很多組再做了，不過各有各的問題。iGEM 2009年就有人做了：

Team:Freiburg bioware/Project

4. 和傳統CRISPR基因編輯的區別以及優劣分別是什麼？

可編程的基因組編輯目前最成熟有效的手段是CRISPR-Cas9，Cas9是一種單體蛋白，可以結合單鏈single guide-RNA（sgRNA），定點的切割sgRNA對應DNA。

對一個基因編輯工具，我們最關心的幾個問題有：

-可靶向的序列

-切割的方式（切一條鏈？兩條鏈？）

-切割酶的效率（NgAgo和Cas9應該差不多，後面不討論了）

-使用、設計的便捷性

-識別序列的長度：太短了不行，會導致靶點太多

-脫靶率：涉及至少兩方面，識別的特異性（對突變的容忍度），遺傳背景的影響（系統正交性）

-拓展性：比如說多靶點同時編輯，比如說基因沉默等功能如何實現

1）不論是Cas9，Cpf1，CRISPR Cascade，都需要PAM位點（protospacer-adjacent motif ）的識別和sgRNA對靶向序列的識別。PAM的序列限制了Cas9等的靶點範圍。而NgAgo不需要PAM位點，從而理論上可以定位於任何靶點。

而且由於PAM在Cas9的脫靶上貢獻「極大」，所以沒有PAM也可以提高相應的效率和特異性。原文比較了NgAgo和SpCas9，發現在GC含量高的區域NgAgo效率更高，而Cas9的PAM序列恰恰也是GC編碼的。

不過PAM因為是Cas9解開DNA雙螺旋的起始位點，其重要也是不言而喻的。沒有PAM的類似物會使得NgAgo在平直的DNA上效率嚴重下降。

2）NgAgo切割的方式很有趣，會隨機抹掉一段靶點內的序列

圖片顯示的對於GFP的切割，對20個實驗結果進行測序後確定的被切割的部分。我覺得目前還不能下結論是好還是不好，需要進一步實驗分析。我猜測可能是會使得同源重組修復變得更有效。

3）NgAgo使用的是 23~25-nt DNA，這是和CRISPR一票的系統最大的不同。

DNA相比RNA的優點也是明顯的，DNA-DNA識別的精確度和效率理論上一般比RNA-DNA識別要高。文章測試了NgAgo對鹼基錯配的容忍度，單個鹼基會明顯降低效率，多個鹼基錯配完全失去活性。這是我認為對比Cas9最大的優勢，Cas9有時候錯配5、6個鹼基一樣可以切。

Figure 4.d （圖傳不上來什麼鬼）圖中G10是正確的gDNA，效率很高，一條高濃度的切割產物。而其他mN的錯配gDNA效率要低很多

識別序列長了一點，差不多4個鹼基，但是如知識分子的報道說理論上準確度提高了1024算是誇大報道的。。首先這個理論上的準確度也不是這麼算的。而且講道理Cas9識別序列總長gRNA+PAM也有25nt了。事實上19nt在目前絕大多數的基因組編輯就夠用了，對於非重複序列能夠保證單一靶點。

但是ssDNA的缺點和限制性也很多，下文詳談。一個比較明顯的就是不能由靶細胞自己生產，用完了就沒了。

4）NgAgo要比Cas9小太多了，很容易放到載體中用來做基因治療。

5. NgAgo的gDNA和Cas9 sgRNA相比的劣勢是什麼？

兩點：不依賴特殊結構，對長度有限制

gDNA不需要什麼特殊結構，這是最大的劣勢。也是我認為從根本上NgAgo不能取代Cas9的原因。有認為不依賴特殊結構是很大的優點的那些言論都是血外行。

搞個核酸結構費不了多大事，沒有成本問題。但是沒有一個特殊結構引發的問題卻很多。

不依賴特殊結構，最嚴重的問題就是導致無法避免的背景的正交性不足：

1）遺傳背景裡面到底有多少ssDNA？人類細胞比較少，可喜可賀。但是別的物種呢？至少原核生物裡面大量的ssDNA。因為不依賴特殊結構，是個ssDNA都能上，這就限制了系統的通用性，凡是ssDNA含量較高的物種都不能用。

2）Deliver引起的問題，如果ssDNA細胞自己沒有NgAgo才能用，那ssDNA就不能由細胞自己生產，必須外源供給，降解了就沒了（NgAgo和ssDNA結合不可逆，因此降解速率可能沒那麼高，但仍然比不上sgRNA可以自給自足）。知識分子的報道裡面張翼提出了解決這個問題的幾個優化方向，仔細想想都可行性都很差：

- 找一個生產ssDNA的方法。說實話做合成生物學的知道這種方法遍地都是，大多數基於反轉錄酶的，馬上就有安全性問題。如果反轉錄用的RNA模板有特殊結構，就沒有安全性問題，但是ssDNA還必須得可丁可卯23~25-nt的長度，不能有附加的部分，這種process是很困難的。如果反轉錄不要求模板的特殊結構，那麼不但有安全性問題，而且沒辦法解決內源RNA被反轉錄成ssDNA，導致脫靶的問題。

- 找一個RNA介導的Ago。這個就是沒看文獻【5】。早在2013年就有RNA介導的Ago了，而且這款RsAgo室溫就有活性。但是仍然不能用啊。使用ssRNA最大的問題就是內源ssRNA從原核到真核全都有，很難把內源的ssRNA和我們設計的ssRNA區分開。而且很多ssRNA都來自於mRNA的正常降解，扔個Ago進去簡直到處都可以剪。

這裡圖C顯示了RsAgo可以利用mRNA降解剩下的一些邊角料作為guide（diRNA）切割外源質粒，並再用之列切下來的片段作為guide（riDNA）反過來切那些還沒降解的mRNA，進行雙重保險的高效免疫。

如果有特殊結構，正交性問題就沒這麼頭疼了，只要分析一下內源RNAorDNA哪些有相應的特殊結構就可以估計背景。

其次沒有特殊結構導致的系統內部的正交性會很差，比如：

3）當我們做真正的editing而不是僅僅做deletion的時候，需要再導入一條ssDNA做模板介導同源重組。那麼這條ssDNA必須得足夠長，否則到時候就會有gDNA和模板DNA競爭的問題。

最後對長度的限制基本上讓NgAgo在除了基因編輯以外沒什麼拓展性可談了。Ago結合13~25nt的ssDNA，這25個鹼基全用來識別了。所以在ssDNA上我們不能設計任何其他功能了。

而Cas9技術在基礎科學的應用上卻可以玩的五花八門，全賴於其gRNA除了識別區段之外，還有很大的空間去設計其他功能，包括不限於：募集轉錄因子控制基因表達（Stanley Qi Lab），募集熒光蛋白進行定點標記（Stanley Qi Lab），加一段lncRNA用來研究非編碼RNA的調控功能（John Rinn Lab），招募一個單鹼基置換的酶（David Liu Lab）etc.

（CRISPR interference (CRISPRi) and CRISPR activation (CRISPRa) for transcription repression and activation. Antonia A. Dominguez, Wendell A. Lim Lei S. QiNature Reviews Molecular Cell Biology 2016）由於所有這些募集行為都可以設計在gRNA上，所以是定點發生的。如果同時在多個靶點上使用Cas9，每個靶點發生的反應不會串流：比如一個切割，一個激活基因，一個抑制基因。

而這種設計對於Ago是不可能的。很遺憾。

6. 為啥不能發個大新聞？

首先恭喜韓老師在如此艱苦的條件下能做出如此impressive的工作。

我覺得很可惜沒能發表在Science上。雖然Nature biotech的影響因子要高於CNS任意一個，但是在大家心中的地位還是不如的。

@李雷說這是學術壁壘的問題。學術明星的確文章稍微好發表一些，所有的social community都有這種看臉的毛病。但是實際上沒有那麼嚴重，發Science都是很難的。

（就在基因編輯圈子裡舉個例子：Andy Ellington Lab之前2013年的時候在提倡一種基於內含子的「Targetron」技術（大概是這個名字），企圖改變Cas9的壟斷效應。當時和Cas9比各有優劣吧，但是@Yang Liu和我在2015年初去的Genome editing的峰會，Andy作報告的時候受眾寥寥，後來也根本沒人跟進。大家都覺得有Cas9就夠了。原始的文章發的雜誌遠遠不如Nat Biotech。而Andy Ellington和Jennifer Doudna是炸藥獎得主Jack Szostak同窗的學生，當年一起發的ribozyme的文章，後來的發展也不錯，算是RNA領域的大牛，然而並沒有卵用。）

我覺得導致這次沒能發個大新聞的主要原因還是：

窮！窮！窮！

上個月Science senior editor Melissa McCartney來我們學校介紹的時候給的統計數據：Science的審稿周期中最難過的一關其實是第一步editor board篩選（90%以上都被退回了），進入同行評議之後的淘汰率其實是50%，並沒有那麼高，只要能把兩輪審稿人要求的實驗都補上而且實驗結果符合預期（這當然很不容易了），一般就發表了。

這篇文章據稱是「審稿人要求的比較完美」所以被拒了。韓老師這篇文章，就憑目前已經發表的工作，我覺得投給Science還是會被評審要求補充實驗的。

所以很可能沒錢、沒條件做這些實驗才不得不放棄的吧。

比如說我覺得至少需要的一個補充的實驗：

-NgAgo是不是會切割RNA？引用文獻12 Olovnikov et al. 2013 Mol Cell的文章中Ago是RNA和DNA都能切的。如果NgAgo不是特異性切割DNA，也切割RNA的話，是不是會影響到內源RNA的表達？但是這個實驗做起來不論體內體外都要麻煩許多。而且如果RNA-seq那又是大把的銀子。

7. 結論：

不管怎樣能夠在艱苦的條件下做出這樣的工作仍是可敬可喜的。

我相信Ago基因編輯也會發展成為一個小熱點。前人已經體外【2】、體內【1】證明了Ago進行基因組編輯的可能性，只不過在體內都不實用（前者是因為高溫，後者是因為使用ssRNA），而這篇文章找到了一個相對可靠地系統。所以我認為這篇文章在Ago未來發展中的地位應該和叢樂、張峰的文章在Cas9中的作用差不多，但是地位上可能稍高一些。

但是和CRISPR-Cas9相比，我認為目前來看還是很難全面替代的，而且根據我對Ago的了解，我也不持樂觀態度。Ago有潛力部分替代Cas9，比如在人基因組編輯。

參考文獻：

1. Gao F et al. Nature Biotech 2016

2. Swarts D C et al. Nature 2014

3. Swarts D C et al. NAR 2015

4. Kaya E et al. PNAS 2015

5. Olovnikov et al. Mol Cell 2013

6. Dominguez A A et al. Nature Review MCB 2016

在這麼艱苦的條件下做出這麼有創新性的結果，真的太N了，Zhang Feng估計看完之後估計會心裡忐忑一番。

如果這個技術真的能夠像他們報道所說的那樣，將會是一個開啟新領域的文章。

我粗略看了一下原文，文章只是個著重於報道發現，在實際應用方面還是一個未知數。所以，我們應該抱著謹慎樂觀的態度去期待他們組跟進的文章。一方面是具體應用的例子，另一方面是系統本身問題的發現與可能的改進方法。

如果通量，應用範圍等各個方面都能夠戰勝Cas9，並且獲得廣泛應用，那這個技術的想像空間非常巨大。可是，正如@張浩千和@Yang Liu所說，目前這個東西畢竟是剛剛發現，離成規模還有距離。很贊成他們謹慎的態度。

剛剛看到了知識分子的專訪，韓老師說目前他們每天會接到幾十封郵件或者數十個電話來洽談合作事宜。

這些人都不是傻子，都知道這裡面的應用前景，也許現在有的地方還不如cas9，但是如果能夠有人follow 一下，完善一下，沒準就能夠堪大用。現在更應該擔心的事情，是如果跟得不好，很可能最主要的應用專利跑到國外。畢竟 gene editing 的市場可不是million能夠衡量的，大家都在盯著看。

大洋彼岸的美利堅，一幫手裡拿著幾千萬，經費的科學界大佬，還在為Cas9技術專利問題打得不可開交。我大天朝，Prof Han用可憐的經費，在非985，211的實驗室里，已經開發了gene edition的下一代技術。

同時，我們也應該反思一下，國內的經費分配體制等一系列科研體制方面的問題。

最後，祝賀在這麼嚴峻學術條件下依然堅守的韓老師和高峰前輩。你們配得上所有的讚美。

謝邀！這一方向也是本人的研究工作。所以我想我應該可以不錯的回答這個問題。首先對作者韓春雨老師表示敬佩，在國內這樣的大背景下，依然堅持一線科研，且有如此的成就。

接下來談談工作。說實在話，不是馬後炮，我們實驗室也就Ago這個工作折騰了兩年時間，除了我們實驗室，我知道國內至少還有兩個實驗也是struggle了兩年左右。

因為Ago沒有解旋酶的功能，所以大家一開始都認為它不能很好地造成DNA雙鏈斷裂。然後也沒有多學科的人去找能夠在37℃下工作的Ago。簡單地說，大家一開始都把這個系統想複雜了。其實汗春雨老師的文章，還是有很多未知的原因。比如說在體外NgAgo只能切割單鏈，但到了體內就可以造成DNA雙鏈斷裂，這是一個很神奇的事情。

特多了，還有很多故事，很多細節。我相信做這一行的人都看到了其中的奧秘。我也相信接下來會有很多文章報道Ago。

其實韓老師的事情讓中國科研界振奮，恰恰反應了國內科研的浮躁。這不稍微有個人做出工作，大家就會激動。如果整個科研大背景健康的話，國民應該是很平淡。不過我也挺韓老師。

祝福知友！

我現在最關心他又沒有把這個技術申請專利。

如果沒有，那就傻逼了。

一群人高潮的太早了，現在幾乎快要被無情的打臉了

韓春雨：「一鳴驚人」的中國科學家發明世界一流新技術 | 特稿 - 知識分子 - 知乎專欄

可以看看知識分子的這篇文章。

節選部分如下：

簡單地說，韓春雨團隊發明了一種新的基因編輯技術（NgAgo-gDNA），適合在人類細胞中基因組編輯，不同於已有最時興的技術（CRISPR-Cas9）。後者通過RNA尋找替換序列，而新技術通過DNA作為介導尋找替換目標。
NgAgo是Natronobacterium gregoryi Argonaute這一短語的簡稱。韓春雨團隊就是利用格氏嗜鹽鹼桿菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute實現了DNA引導的基因組編輯，並發現NgAgo作為一種DNA介導的核酸內切酶，適合在人體細胞中進行基因組編輯。
Argonaute作為一個核酸內切酶家族，最早由荷蘭瓦赫寧恩大學(Wageningen University) 的約翰-范德歐斯特（John van der Oost）研究組證明這一家族的同源蛋白酶活,可以有效地利用單鏈脫氧核糖核酸作為短介質，去相對精準地切割基因組靶點。
范德歐斯特的這一發現開啟了基因組工程的一個新篇章，因為之前的大多數基因組工程研究是基於RNA的（CRISPR-Cas9、TALEN等，鋅指蛋白是基於DNA的但是沒有實現可編碼的優勢），哈佛大學分子與細胞生物系副研究員段昕認為，「這一進展給大家引入了一個新的思路去進一步改造」。
目前世界各個實驗室最為流行的基因編輯工具是CRISPR-Cas9。從原理上來說，早期的DNA編輯技術是通過蛋白（如鋅指蛋白）來尋找需要替換的序列，而Cas9則是通過RNA（引導RNA，即gRNA）來尋找替換的序列，由於比操作蛋白質簡單得多，Cas9技術得以迅速被廣泛使用。
但是，Cas9需要19個配對的鹼基，並且要求在需要編輯的基因組上這19個鹼基後面必須緊鄰一個符合一定特徵的三鹼基序列（PAM序列），這在一定程度上限制了gRNA的設計，而NgAgo–gDNA系統不需要PAM序列，拓寬了其設計範圍。
NgAgo結合24個鹼基的gDNA，這比Cas9的gRNA（19個鹼基）要長5個鹼基，理論上其精確性要提高1024（4的5次方）倍。DNA編輯相當於在一本書中的某個位置找到一個單詞將它替換成另一個單詞，並且要保證書中其它地方的單詞不被替換。顯而易見，如果替換的是the這樣的簡單單詞，那麼可能從書中找到多個地方，而找pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi這樣的單詞則不太可能找錯。
韓春雨團隊的研究還發現，NgAgo–gDNA系統對嚮導序列-靶序列錯配容忍度很低。gDNA上任何一個鹼基的變換都會降低NgAgo的切割效率，如有三個錯配則使其完全失活。這在另外一個機制上提高了NgAgo使用的精確性，特別是一些富含GC序列的地方，NgAgo系統比Cas9系統效率更高。
NgAgo的gDNA需要5』端磷酸化的單鏈DNA （5p-ssDNA），這種形式的DNA在哺乳動物細胞中幾乎不存在，這保證了NgAgo不會被內源的DNA序列錯誤帶到不該去的地方。該系統的另外一個優點是5p-ssDNA是外源轉化進細胞的，其時間和濃度可以非常精確地控制。而Cas9系統的gRNA是內源表達的質粒,難以精確地控制。
韓春雨團隊在論文中還介紹，與Cas9相似，Argonautes在基因表達抑制及抵禦外源核酸中起關鍵作用。但是，Argonautes在許多方面不同於Cas9。比如，Cas9隻存在於原核生物中，而Argonautes在進化過程中保守，存在於幾乎所有生物體中；儘管大多數的Argonautes結合單鏈(ss)RNAs，在RNA沉默中起重要作用，一些Argonautes卻可以結合ssDNAs並切割靶DNA；正確的Cas9結合要求嚮導RNA必須有一個3′RNA-RNA雜化結構，而Argonaute結合則不要求特異的一致的嚮導RNA二級結構；Cas9隻可以切割PAM上游的靶序列，而Argonaute不要求靶序列上存在特異的序列。當Argonaute與嚮導序列結合時，它們可以影響彼此的生物化學特性，並作為一個整體起作用。
「因此，從理論上說，NgAgo的脫靶率更低。」

這是河北科技大學在知乎上地位最高的一次了！！！不誇張的說大多數人都沒聽說過這個學校吧。在極其一般的條件下能得出這樣的成就讓人敬佩不已。小生是科大一名大四學生有幸能和韓老師在一棟實驗樓上工作。但是專業不同，也對其沒有了解。所以沒有資格評價。最後向辛苦的科研工作者致敬！！！

這是一項具有劃時代意義的基因編輯技術。

第一，克服了csa9存在的一些問題，比如脫靶。

第二，直接編輯DNA，操作更加簡便。

第三，說得愛國點，打破了美國人對基因編輯技術的壟斷。

這是我自己看完Nbt文章後的一點想法跟大家分享：感覺。。現在這個NgAGO還很不成熟，而且有個硬傷。它只要是5"P的短DNA都可能當成gDNA，哺乳動物體內本身就必然有類似的DNA，那麼只要過表達NgAGO就可能有match而產生break；這不像是Cas9，它的gRNA還得有個scaffoldRNA，內源就不會出現gRNA。。當然文章裡面說這種內源的模版很少。不過這會大大降低其可能的運用。不過它還有個特性是，結合gDNA之後在37度不容易解聚，那是不是說可以考慮重組蛋白先在體外跟靶gDNA結合之後再導入細胞來減少內源gDNA的影響。其次，它會隨機移除幾個鹼基，這種特性有好有壞吧，不過應該對NgAGO之後的改造能解決這個問題。確實ssDNA作為模版比RNA好太多了，而且對mismatch的容忍也更低，DNA也不容易出現二級結構。

同樣的這個答案也寫在了饒毅老師的文章評論里

謝謝邀請，我這裡借用我們實驗室牛人@草木也知愁對這個技術相比CRISPR系統高度精鍊的優勢總結：

1. 無需PAM結構，靶點選擇更靈活，範圍更廣。

2. DNA-DNA雜交系統，gDNA只需要大概5端磷酸化的24mer單鏈。

3. NgAgo比cas9小1/3，(887 氨基酸 vs. 1368 氨基酸)。4. 切割靶點時，會同時切除幾個核苷酸。

5. 錯配容忍度更低，一個錯配切割效率降低，3個錯配基本無活性。

6. 使用guideDNA而非gRAN,且使用劑量只需後者的十分之一。

但是相對CRISPR/Cas9，NgAgo還算是基因編輯領域的新生，還需要更多的磨鍊和改進，需要在更多的系統中來驗證。

謝邀，母校本學院的老師。去過他的實驗室，並且也認識韓老師。當年小憤青老師，學生們多多少少都聽過他的事迹。

今天只想說，無論其他如何，踏踏實實做研究就是值得稱讚。並且寢室有人就是他的學生，所以我認為也只有他們這樣的團隊，能出成果。

想起有些研究模式，汗顏。

贊一個

他這篇文章沒有受到任何基金的支持，據說是用自己的錢支撐研究的，我只能說這臉打的太狠了。

剛剛看到韓春雨教授北大講座的推送

關於文章中的實驗的細節問題的一些個人觀點：

1、文章中的關於證明哺乳動物細胞內含有很少的5』P-ssDNA的實驗證據不夠強。韓春雨團隊使用的純化後的NgAgo蛋白進行電泳檢測核苷酸的存在。這個實驗的靈敏度不夠高。即使有少量的結合的ssDNA結合，在這個檢測中也不能被檢測到。而這樣的低濃度的不能被檢測到的ssDNA會不會介導NgAgo對基因組進行切割也是缺乏實驗證據的。

2、類似的，在最後一個實驗中，在哺乳動物細胞中進行基因敲除（Knock out）和敲入（Knock In）如果有全基因組的測序分析，便能更好的說明是否有脫靶效應的存在了。同作者在原文中提到的，這些內容還需要未來高通量的分析才能確定。

3、韓春雨團隊認為在體外的質粒切割實驗中，單條的gDNA只能引起靶標質粒單鏈的斷裂，僅僅在互補的兩條gDNA存在的情況下才能引起雙鏈的斷裂。而在體內則僅僅需要單條的gDNA則能引起雙鏈的斷裂。對於這一點，韓春雨的團隊認為是體外實驗因為使用了55℃置換gDNA，所以導致了酶活性的降低。而在體內的裝載gDNA是37℃，不會破壞酶活性，所以出現了這樣的情況。個人認為，體內單個的gDNA既能導致雙鏈的斷裂是因為細胞內單鏈的DNA斷裂會引起細胞的DNA修復機器的運作，而這個過程中，細胞內的其他酶導致了另外一條鏈的斷裂。這個假設可以通過在體內（37℃）的環境下裝載gDNA，再純化後做體外的實驗。預期結果：這樣裝載的NgAgo-gDNA在單條gDNA的情況下也只能夠引起靶標質粒的單鏈斷裂。

當然，以上僅僅為基於文章內容的個人觀點。

韓春雨的團隊的這項工作的價值是值得讚美的！

自己寫了一下關於文章的實驗細節，有興趣的可以看看：一種可能完勝CRISPR/Cas9系統的基因編輯工具：NgAgo-gDNA系統

感謝韓春雨團隊，無數博士博後又有要經費的課題啦

目前為止沒有成功案例學術界已經有較大信任問題

目前基因組編輯領域有點象當年的PCR，概念有了，Taq酶也研發出來了，而且已經優化了好幾版了，以後Taq酶還會進一步被優化，而且還會有qPCR, digital PCR 等技術被開發，但是不會有PCR原創性高了。

現在主要還是拼專利。

韓春雨確實申請了專利

但是，目前已經有人搶先申請了。

花了好多時間寫的，還是覺得應該先來個總結比較好。

我個人不看好NgAgo在未來一段時間成為廣泛使用的基因編輯工具，目前NgAgo有一些讓人興奮的功能，但是也有致命缺陷。

也看了一下其他答案，有許多類似於「NgAgo比Cas9小」之類的論據我沒有提，是因為我覺得沒什麼意義，以現在的技術來講，這些優缺點不會對基因編輯工具的性能產生影響。

另外還有一點是我確實沒有想到的，就是Cas9的gRNA有多於的序列用於修飾，可以實現其他的功能。最近Nature biotech上發了一篇CRISPRainbow的文章，就是利用gRNA連接了熒光蛋白，效果十分炫酷，但是已經超出DNA編輯的範疇了，我覺得不列出來也罷。

還有就是下周韓老師要來北大給talk，如果我去聽了的話還會更新（破十贊就更）

-------------------------------------------------------原答案---------------------------------------------------------------------------

雖然只是一介本科生，但是最近也查了很多資料，應該比較靠譜。

現在最火的基因編輯技術是CRISPR-Cas9系統，這個系統在2013年最先被證實可以在動物體內進行基因編輯，做出這個成果的是華人科學家張峰，也是近年來呼聲很高的諾獎候選人之一。

下面對比一下CRISPR和NgAgo有什麼異同，關於NgAgo的信息主要來源於韓春雨最近的那篇paper。

所謂基因編輯的第一步就是要把原來的DNA切開，這裡最重要的就是要準確找到我們想切割的位點，之後的事情都好說。之前基因編輯的主要工具鋅指蛋白和TALEN是用氨基酸序列來匹配特異性的DNA序列，想識別一小段DNA序列就需要設計幾千個氨基酸，成本高昂而且工作量極大。CRISPR是利用gRNA（guide RNA）來尋找目的基因序列並進行切割，而NgAgo是利用gDNA尋找目的基因，二者只需要一段20個左右鹼基的RNA或者DNA就能識別特異型序列。這裡的gRNA和gDNA都很容易人工合成，Cas9和NgAgo的轉基因也很容易實現，因此在使用的成本和便利性上二者差異不大。

接下來是具體的編輯能力，主要考察的是編輯的效率和有沒有脫靶效應。

CRISPR-Cas9受限於PAM序列，切割位點有一定限制。具體來說CRISPR不是想切哪就切哪，不過如果你想重組或者突變一個基因，有幾千bp，基本上不會找不到PAM序列，但是要做更精確的操作就要看臉了。。。而NgAgo目前來看想切哪切哪，只要gDNA配上就ok。

對一個二者都能處理的序列，一般情況下切割的效率基本沒有差別（都不是100%，20~30左右），但是富含CG鹼基對的序列CRISPR基本處理不了，而NgAgo可以照常切割。基於以上兩點，NgAgo在效率上略勝CRISPR一籌。

脫靶率上，二者都不高，理論上NgAgo的脫靶率更低，這是因為CRISPR-Cas9的gRNA如果跟DNA有少數幾個錯配，切割仍然會發生，而NgAgo對錯配的容忍度更低。所以可靠性上NgAgo又略勝一籌。

這兩個略勝一籌基本上就是NgAgo相比於CRISPR的所有優點了。還有其他一些玄學因素，比如細胞里出現其他gRNA的概率比gDNA的概率高，然而這就跟你被雷劈死的概率比被外星人打死的概率高一樣，沒什麼卵用。

下面是NgAgo的一些缺點。

NgAgo現在只有韓春雨的一篇文章，而CRISPR在這幾年突飛猛進，發展出了各種各樣的變形，有各種各樣的功能，在NgAgo沒有革命性優勢且可靠性得不到證明的情況下，各個實驗室是不會拋棄自己辛苦建立的CRISPR-Cas9品系的。

最重要的最後說，NgAgo有一個致命的缺陷，就是這個系統使用的gDNA只能外源提供，而CRISPR的gRNA可以通過轉基因的方法在生物體內持續表達，所以想用NgAgo做轉基因動物的基因編輯難度很大，目前能想像到的只有在受精卵中進行NgAgo操作才能得到基因編輯的動物，而這種方法只能得到全身表達編輯基因的個體，沒辦法像CRISPR一樣進行組織特異性的基因編輯了。而且結合NgAgo只能切負超螺旋的DNA這個特點（這個是之前別人研究過的，韓春雨沒提），就算是卵細胞編輯都有很大的局限性，所以在實用性上NgAgo現在遠不如CRISPR-Cas9。

其實Ago中有一部分跟CRISPR一樣是利用RNA來尋找DNA序列的，其他指標能夠媲美NgAgo，這些酶才真正有潛力代替CRISPR。

題外話，韓老師的工作真的很不容易，如果後面有人能重複出來他的工作，還是挺勵志的一個科研故事呢~