北大魏文勝對韓春雨的指控有無漏洞？

12-29

韓春雨事件最新進展-----13位科學家實名呼籲對韓春雨啟動調查：為了中國學界的名聲

文章中有下面一段話：

韓春雨即使不涉及學術造假，也已是學術不端

魏文勝向澎湃新聞分析道，出現這樣的現象，有3種可能：

1.NgAgo技術是高效的基因組編輯技術，但國內外至少上百家實驗室的效率為零，唯一可能是相關課題組隱瞞了關鍵的實驗步驟；

2.NgAgo技術能夠工作，但是效率很低；而國內外至少上百家實驗室的嘗試為不工作，則課題組在論文中嚴重誇大了NgAgo的效率；

3.完全不工作

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有一個關鍵問題被魏文勝忽視：這上百家實驗室，其中究竟有多少家是無法重複實驗，又有多少家是無法推廣韓的實驗。推廣和重複這是兩個截然不同的概念

就拿《13位科學家實名呼籲》一文中的王立銘做為例子，他的個人聲明中白紙黑字寫著這樣一段話：
當然，我必須再次說明，我們的工作，實際上是對韓教授論文結果的推廣，而非簡單「重複」。從邏輯上說，NgAgo在果蠅胚胎中沒有基因編輯活性，並不能證明NgAgo方法存在錯誤，更加不能簡單推導出韓教授團隊存在學術不端的嫌疑。也可以說，我們每個獨立的生物學實驗室，都可能可以測試NgAgo在不同條件下的工作效率，但是NgAgo方法是否存在錯誤、是否存在學術不端，需要更審慎、更嚴格的調查。

魏教授對韓春雨涉嫌學術造假學術不端的指控，是不是不夠嚴謹，存在「漏洞」？

瀉藥。
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的確『延伸試驗』跟『重複試驗』不是一類的。所以整個討論有必要區分開：-
1. 單純的重複性試驗；這個很簡單直接就不多談了，條件相等就是AA/AB/BA/BB（這也是韓一直避免的）
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2. 延伸試驗；此試驗不具有可比性，但基礎是一樣的，且最終NgAgo還是需要延伸開方有研究價值，所以還是有一定的參考性。在論文里所提及的simple and efficient 簡潔及高效在此可以得到很好的參考，此技術是否具備挑戰CRISPR的能力，一目了然。
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3. 如果單純以重複試驗及延伸試驗比例來推翻魏老師所言的『學術不端』恐怕有難度，重點並不在於實驗室的數量，而是試驗數據的質量。特別是根據韓新的protocol後面所作的試驗幾乎可以肯定是嚴格按照程序進行，質量會有很好的保障。
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4. 就13家的數據已經足夠另韓無法解釋，解開迷惑的途徑無非就那幾種，最有效/直接的就是拿出原始數據。除了證明自己做到了，還證明沒有蓄意隱瞞任何步驟或細節。

好比韓春雨在論文中說我發明了一把叫ago的屠宰刀非常鋒利非常高效而且比現有的cr刀用起來更方便，使用手冊介紹了如何製作這種刀，並且以殺豬為例證明這把刀的優點。廣大屠夫們興奮了，按照韓的方法和流程製作了這種刀，按照不同的用途來使用，結果有人反映發現殺不死牛，有人反映殺不死雞，有人說殺不死羊！韓辯護說你們沒按我的流程重複，大家於是按韓的要求去殺豬，發現居然也殺不死。韓又說殺豬需要高超的技巧，你們的殺豬技術不行。
屠夫們一聽怒了，老子殺了幾十年豬還比不上你這個小屁孩啊，你tm到底是在耍我們還是在騙我們啊？

我就問，你看過韓的論文和饒毅吹噓韓的成果的意義的文章沒？沒看過就別出來逼逼。
韓吹噓自己的工作，是高效的，具有普遍適用性的，所以才被視為CRISPR技術的替代者，才能吹到所謂諾獎級。你TMD現在告訴我，哺乳動物能用，果蠅啊植物啊細菌啊統統不能，這叫普遍適用？你40%多的剪切成功率現在就成了曇花一現？你論文里切了多個基因均表現高效，可重複，現在TMD就都重現不了？你要一開始這麼寫NBT會給你發？

提問前先盡量收集相關信息是個好習慣。
拿王立銘這句話作為對魏文勝批判的證據，大概跟拿David稿件裡面說有三例匿名重複所以《Nature》證明實驗可重複是一個水平。

13個課題組實名聲明：無法重複韓春雨實驗

附：目前公開聲明未能重複實驗的部分課題組名單
1 北京大學生命科學學院魏文勝課題組
我們使用了文章中報道的高效ssDNA，同時自己設計了其他2條針對體內其他基因位點的ssDNA，與NgAgo表達質粒共轉HEK293T細胞與HeLa細胞，2天及5天後，用T7E1檢測切割效率，這三條針對2個不同基因的ssDNA，在HEK293T和HeLa兩個細胞系中，無論轉染一次還是在8到12小時後再轉染一次ssDNA，都沒有檢測到切割。
針對敲除後能使細胞有表型變化的某特定基因，我們設計了ssDNA，與NgAgo表達質粒共轉HeLa細胞5天後，發現細胞表現出了一定的對應表型，但是把這部分細胞收集起來提取基因組，對靶位點測序，沒有發現基因組序列的任何改變。

我們針對某特定基因設計了6種ssDNA，用特異的熒光報告系統檢測是否有靶點DSB產生，結果顯示所有實驗組均沒有檢測到對靶位點DNA序列的切割活性。
2 中科院動物研究所王皓毅課題組
我們在293T細胞中表達帶有Flag標籤的NgAgo ，在不同時間點檢測NgAgo蛋白表達。發現轉染6小時後開始檢測到目的蛋白，隨著時間的延長蛋白量增加。在人類293T細胞系中重複原文章中Figure 4b中NgAgo對DYRK1A和GATA4兩個位點的基因編輯，使用文章中發表的guide DNA (gDNA)。具體實驗方法為NgAgo分別與相應的gDNA共轉染細胞，6h、12h後進行相應gDNA的再次轉染。轉染後3-4天收集細胞進行Surveyor assay，未檢測到目標位點目的條帶的切割, 測序也未發現突變。結果未能重複Figure 4b。
我們也進行了原文章里的Figure 3切割GFP質粒的實驗，使用文章中的eGFP gDNA G3，轉染2天後，觀察熒光表達和進行流式檢測， NgAgo+gDNA G3，NgAgo+ 靶向其他位點的gDNA ，pUC19+G3， pUC19+5』端沒有磷酸化修飾的gDNA，以及單獨轉染gDNA 都能夠明顯降低eGFP表達。針對質粒目標位點的genotyping（Surveyor assay，PCR以及測序），未檢測出任何突變。結果未能重複Figure 3 .

我們所使用的細胞定期進行支原體檢測，未發現任何細胞污染。
3 中科院上海生科院生化與細胞所李勁松課題組
我們主要做了兩方面的實驗：一個是在Oct4-EGFP的小鼠受精卵中進行NgAgo mRNA和gDNA的注射，嘗試了不同的濃度組合，在囊胚的時候也有看到不亮或者發光很弱的情況，但是測序發現序列並沒有突變；另一個是在細胞水平，我們最初是在Oct4-EGFP的單倍體細胞共轉NgAgo和gDNA載體，分選雙陽性的細胞直接測序或者培養後測序，均沒有突變。我們開始懷疑NgAgo的表達窗口比較窄，就改造載體建立了穩定表達Ago的細胞系，依然沒有突變。後面我們就完全按照NBT文章里的實驗，在293T細胞中打靶hDYRK1基因，gDNA的長度位置都和文章一樣，還是沒有能突變。
4 浙江大學聲明科學研究院王立銘課題組
我們實驗室在韓春雨論文發表一周內就索取了NgAgo的DNA載體，並立刻計划了對NgAgo方法的測試。在兩個月多達上百次的實驗中，在我們測試的所有條件中，我們都沒有觀察到NgAgo方法對果蠅基因組的編輯活性。

5 北京大學生命科學學院孫育傑課題組
我們使用了原始菌里來源的和人工合成的密碼子優化的NgAgo，嘗試了公司合成的磷酸化gDNA和自己使用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231細胞中的laminB1和LBR基因，每個基因五條gDNA，通過T7 assay均未見切割。同時，我們切割整合在基因組的gfp基因，使用韓春雨文章所用的gDNA，流式檢測也無gfp熒光的下降。我們還將NgAgo融合了熒光蛋白，使用靶向telomere的gDNA，使用高倍熒光顯微鏡沒有發現NgAgo在telomere處的富集。
6 中科院動物研究所李偉課題組
我們在哺乳動物細胞和胚胎水平進行了基於NgAgo的基因組靶向突變實驗，採用了包括韓文章中報道的293細胞和4個完全相同的guide序列和，結果均為陰性，均沒有檢測到靶向DNA突變產生。具體進行的實驗包括：1、利用體外原核表達純化的NgAgo和韓文章中報道的4個guide序列進行37°單鏈DNA切割，結果：37°沒有檢測到DNA切割。2、哺乳動物細胞實驗。按照文章附件中的方法，在293細胞分別轉染韓文章中的 G5,G10,G27,G28和自己設計的Mecp2基因guide序列，T7EI酶切檢測沒有檢測到靶位點突變。進行guide-DNA連續轉染實驗，在轉染後8h,12h 補充轉染guide 依然沒有檢測到靶位點的突變。3、小鼠胚胎實驗：選取Mecp2和stella 位點分別設計若干guide序列，連同NgAgo mRNA一起進行細胞質注射，收取囊胚檢測，T7EI和測序分析均沒有檢測到靶位點突變。
7 中科院上海生科院神經科學研究所研究員楊輝課題組

我們針對小鼠胚胎的GFP基因、Tyr基因分別設計了四個gDNA（在三家公司都試過合成了），NgAgo用了三種不同版本（密碼子優化或者NLS在N端、C端），操作幾百個胚胎，生了三百多隻小鼠，都沒有檢測到敲除。之後我們又在細胞水平針對猴的Tyr基因、293的GFP基因、N2A的Tyr基因進行操作，也沒有檢測到任何基因編輯。最後我們完全按照韓文章中fig4的DYRKIA基因進行操作，也完全沒有效果。
8 上海交通大學吳強課題組
TtAgo被發現在高溫下可以在體外通過gDNA指引內切單鏈DNA，PfAgo在高鹽條件下可以切DNA單鏈，NgAgo可能是一種嗜鹽鹼古桿菌中含有類似RNaseH結構域的單鏈RNA內切酶，但也可能內切DNA單鏈。我們利用密碼子優化後合成的NgAgo做了以下體內編輯實驗，我們沒有做體外實驗：
1 單位點：不管是人工合成的5『端磷酸化gDNA，還是利用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5』端羥基得到的gDNA，在小鼠胚胎、小鼠N2A細胞、人HEC-1B細胞中均沒檢測到活性。

2. 雙位點：三個學生花的力氣最大。至少做了三個不同的DNA片段，做了不同溫度、鹽離子濃度、多次轉染、先體外合成NgAgo蛋白再轉染、不同的Tag或核定位序列，也試了不同的細胞系。我們是用PCR檢測DNA大片段敲除，這個方法很靈敏（用CRISPR/Cas9很容易做出來），因為只有在片段敲除的情況下才能擴增出PCR產物，哪怕效率很低也應該能檢測出來。PCR產物經過克隆再測序，但從沒有檢測出片段敲除的正確結果。

9 溫州醫科大學谷峰課題組
我們利用攜帶GFP的人類細胞，同時導入磷酸化的gRNA和NgAgo表達質粒（做了多個不同濃度梯度和重複），希望特異的看GFP敲除，以CRISPR/Cas9做陽性對照，但是NgAgo組我們沒有能夠檢測到GFP的失活。這個實驗我們後面又重複了，但是仍然沒有看到切割。所以此時，我們高度懷疑NgAgo的活性，該項目就先停了。

瀉藥
這次實名出來的十三位裡面就有一半以上的人在自己的系統不work後轉而去嘗試韓文章中的體系，結果仍然不work

您的洗地角度還是比較獨特的，不知道為什麼最近不活躍了，搞得現在只剩一些沒水平的在洗地。所以請您務必堅持下去。

魏文勝話得說好聽了點而已，其實1 2都是在那些噴子面前打馬虎眼的，3才是他真正想說的東西。

一般是推廣，一開始也不會懷疑。但肯定有重複韓的實驗的，當做positive control

北大魏文勝對韓春雨的指控 有無漏洞？

北大魏文勝對韓春雨的指控有無漏洞？