2016.11.11這篇跟NgAgo有關的實驗文章，大家怎麼看？
Cell Research在光棍節2016.11.11發表了一篇文章：
http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr2016134a.html
有人看過了嗎？--------------------------------------------------------------------------------
一些老師看過後的評價是：
不能切割，但可以抑制因表達，並不能支持韓教授的實驗結果
卸腰。
文章內容實際上就兩條：
1. NgAgo不能在斑馬魚里做基因組編輯（knockout）
2. NgAgo能夠抑制RNA表達（knockdown），機制不明
與韓春雨所聲稱的NgAgo的功能完全相反：NgAgo可以進行基因組編輯，並排除了表達量下降是由其他原因造成的。
綜上，我的觀點是，本文指出韓春雨文章對NgAgo功能的描述完全不靠譜。
(P.S. 剛剛看到BioArt的採訪，通訊作者劉東「含蓄地表示」：「並沒有支持或反駁韓教授的結果」。這個用詞很精準…這篇Cell Research文章還不足以反駁韓的結果，但是給出的結果毫無疑問是導向質疑者一方的。如果來自古細菌的NgAgo蛋白，能夠在八竿子打不著的斑馬魚內和人內表現出了完全不同的功能活性，那麼我們有理由認為，最可能的原因是至少一方的結論是錯的。如果CR的實驗能在其他實驗室重複，那麼在至今無人能重複韓的實驗的情況下，我們有理由推斷韓是錯的。事實上，根據以往的報道，抑制基因表達但無編輯的現象，其實已經在人細胞、小鼠等多種模式系統中出現過了。）
我覺得這篇文章一些細節的實驗和分析並不是很嚴謹，如果真是文末指出的NgAgo可能和dCas9一樣是阻斷RNA生成的，那麼圖E一邊用NgAgo一邊注射mRNA，手怎麼這麼准就能可丁可卯的把mRNA總量拉回和正常值差不多了？這顯然是說不通的。NgAgo-gDNA是不是能夠結合DNA，這地方都要存疑。如果NgAgo-gDNA結合mRNA誘導降解，阻斷蛋白質翻譯，考慮到脊椎動物Ago本來就是負責RNA降解的，反而更有可能。
但是主幹內容還是比較可信的。期待有更多這樣的文章出現。
背景知識介紹略過，廢話不說了，懂的都懂，不懂的也不關心細節。總之NgAgo要完。
Ago家族在脊椎動物和高等植物中的同源蛋白本來就擔任RNA切割降解的功能，RNAi和miRNA都是依賴Ago起作用的，所以降解mRNA倒也在情理之中，不過這樣NgAgo就沒什麼實用價值了，用這個工具還不如直接RNAi。
而且以前就有人在別的體系中提出類似結果，韓教授的根本理論(NgAgo是編輯基因而不是RNAi)實質上已經被推翻了。看到這篇論文第一反應是不可思議，這麼多優秀研究人員無法重複出來的工具竟然可以使用了？既然論文已經發表，說明經過了同行評議，論文結果正常情況下是可信的。那麼這篇論文說明NgAgo是有效的嗎？這篇論文支持了韓春雨的結論了嗎？那那就需要耐心讀一讀論文了。
我們先來看一下論文的數據。該研究組使用了進過優化的NgAgo,針對影響斑馬魚眼部發育的基因 fabp11a設計了gDNA。
研究人員把gDNA和優化的NgAgo的mRNA共注射進斑馬魚單細胞期的胚胎。結果這些胚胎有30%發育出有缺陷的眼部。
NgAgo居然work了？先別急著下結論，見證奇蹟的時刻來了，Sequencing!!!
"Unexpectedly, Sanger sequencing did not uncover any DNA sequence alteration in the targeted region from 57 embryos with eye phenotype we analyzed (data not shown). "
靶標的基因並沒有發生任何改變！
然而，「real time reverse transcriptase (RT)-PCR analysis revealed that the fabp11a gene expression was down-regulated」。原來是目的基因下調導致的！
研究人員接著又試了另外一個基因ta（還試了kdrl, lama1 和 ?t1）, 結果也是有30%的表型，基因水平被下調，沒有indel!
由於斑馬魚適宜的生長溫度不是37℃，上述實驗是在28.5攝氏度進行的，和韓春雨報道的37℃並不一致。雖然32.5℃可能會導致斑馬魚發育畸形，研究人員還是試了37℃的條件。發現37℃下有超過一半的胚胎髮育正常，但是在NgAgo引起眼部表型的胚胎依然沒有檢測到indel。也就是說NgAgo系統在斑馬魚胚胎中並不能進行基因編輯。
研究人員還進行了一系列實驗證實斑馬魚基因下調的確是由gDNA/NgAgo系統導致的。NgAgo既然無法對基因組進行編輯，又是如何導致基因下調的呢？
研究人員測試了NgAgo的多個突變體，結果發現多個沒有催化活性的NgAgo同樣可以實現目標基因的下調，同時也沒有檢測到任何indel。這樣就進一步證實基因下調不是由於NgAgo切割基因組導致的。
最後論文作者推測gDNA/NgAgo可能和靶基因結合，阻礙靶基因的轉錄從而引起基因表達水平下調。因而論文作者賦予了gDNA/NgAgo敲低目標基因的新生命了。
至於NgAgo是否能有效進行基因編輯，韓春雨是否可信，這篇使用了gDNA/NgAgo系統的論文結果顯示的信息依然是Negative。
轉載一篇公眾號BioArt原創的一篇很好的相關說明文章：
BioArt原創丨NgAgo波瀾再現—Cell Res發文否定NgAgo基因編輯功能，附論文作者點評
11月11日晚上8點左右，Cell Research雜誌以Letter to Editor形式在線發表了來自南通大學和復旦大學研究人員合作完成的題為「NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish」的論文（下圖），該文結果表明 gDNA/NgAgo 系統在斑馬魚中能實現特定基因敲低導致魚眼部發育缺陷，但是不能對靶基因進行基因編輯。（注：文末附有該文通訊作者劉東博士和作者之一復旦大學王永明研究員的介紹和點評）
這篇文章中作者的研究的靶基因名為Fabp11a（Fatty acid binding protein 11a，脂肪酸結合蛋白11a），該基因在參與調解葡萄糖和脂代謝穩態方面具有重要作用，但是在斑馬魚胚胎髮育中該基因的功能未知。對此，作者想知道NgAgo系統是否能在斑馬魚中工作，針對Fabp11a基因設計了兩條5"-磷酸化的ssDNA（下圖1），與優化過的NgAgo-2nls mRNA一起注射到1細胞期的胚胎中，有趣的是他們觀察到注射過的胚胎中最終約有30%會產生嚴重的眼部發育表型。第一類表型：眼部有一隻相對小一點的眼睛而另一隻顯得十分小；第二類表型：兩隻眼睛融合形成一隻較大的眼睛（見下圖2）。
為了證明是否斑馬魚出現的表型是由於Fabp11a基因遺傳突變造成的，作者抽提了正常斑馬魚胚胎和突變斑馬魚胚胎的DNA對靶基因進行PCR擴增，結果測序結果表明靶基因沒有發生任何基因突變，但是通過RT-PCR檢測Fabp11a基因的表達驚奇的發現該基因的表達有顯著敲低（見下圖E）
為了更清楚的說明問題，作者進一步做了一些實排除了單獨由NgAgo-2nls mRNA或者gDNA注射到胚胎導致的表型，而且同時注射NgAgo-2nls mRNA和錯配的gDNA也不會產生表型，這些實驗結果表明gDNA/NgAgo系統有其特異性。另外實驗結果表明gDNA/NgAgo系統靶向敲低Fabp11a基因導致的斑馬魚眼部的表型可以通過注射Fabp11a mRNA回復表型（見上圖D）。
為了進一步確認gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中敲低基因是一種普遍的現象，作者又test的另外一個基因ta（no tail/ntl or brachyury），結果表明也有大約30%注射過的胚胎出現沒有尾巴的表型（見下圖）。
此前韓春雨NBT文章中表明gDNA/NgAgo系統在人源細胞（37℃）中能夠有效的產生11.2%-41.3% 的indels。Cell Res這篇文章中也在37℃的條件下檢測了斑馬魚中gDNA/NgAgo系統是否能產生indels，結果表明沒有檢測到任何indels發生。有趣的是在正常情況下，斑馬魚胚胎中注射gDNA和酶活突變的NgAgo mRNA也能產生系列表型，當然同樣檢測不到任何indels的發生。為了再進一步確認斑馬魚的表型是由於Fabp11a敲低造成的，作者還做了一些後續的原位雜交實驗，而且還運用CRISPR/Cas9技術敲除Fabp11a基因也能得到相似的表型，當然基因敲除的表型顯然異常劇烈一些，有約10%的胚胎出現眼睛消失的表型。
總的來說，這項研究結果通過使用gDNA/NgAgo系統在斑馬魚中實現了特定基因的敲低，但是沒有檢測到靶基因上任何indels的出現，因為酶活突變的NgAgo也能產生敲低的效果，作者猜測這個系統可能和酶活突變的Cas9：sgRNA系統類似都能在靶基因處抑制基因轉錄。
論文作者簡介
這項工作是由南通大學江蘇省神經再生重點實驗室劉東副教授領銜完成，根據該實驗室官網資料顯示，劉東於2011年從德國馬克斯-德爾布呂克分子醫學中心/柏林自由大學獲得自然科學博士學位，從2012年8月起任南通大學神經再生重點實驗室副教授，2013年起擔任碩士研究生導師，目前是中國解剖學會再生醫學專業委員會委員，江蘇省發育與細胞學會理事，其主要研究方向為：
1、鑒定參與血管新生以及神經系統發育過程中的全新的調控分子。
2、組織再生過程中血管化的過程及調控機制。
3、利用多種遺傳操作技術建立轉基因和基因敲除斑馬魚模型。
4、篩選調控血管內皮細胞和運動神經元行為的天然化合物。
論文另一位合作者是來自復旦大學生命科學學院的王永明研究員，他曾於2015年入選中組部青年千人計劃，主要研究方向是建立高效的CRISPR/Cas9基因編輯技術用於通過建立疾病模型和篩選相關治療藥物等。
文章的通訊作者劉東博士對該項該項研究的說明（微信採訪）：我們的研究是在斑馬魚模型上做的，我們沒有發現indels，但是可以抑制基因表達，推測是結合到了DNA上，阻止了轉錄。並沒有支持或者反駁韓教授的結果。實際上這個研究是我們意外的一個小發現。文章共同作者之一王永明研究員對該項工作的介紹和點評（微信語音採訪）：這個工作大約在韓春雨NBT文章發表後一個月開始著手的，然後前後大約做了5個月，最初的想法是運用這個新技術在斑馬魚里對自己感興趣的基因實行基因編輯，看看效果怎樣，但是並沒有想到是如今論文報道的這個結果。在斑馬魚里以前主要是用morpholino的手段敲低基因表達，但是這個文章告訴我們gDNA/NgAgo系統也能實現目的基因的敲低並且效率上也有一定優勢，所以這個工作對於在斑馬魚里敲低基因表達還是十分有意義的。
溫州醫科大學谷峰教授（13位實名呼籲對韓春雨啟動調查的學者之一）對該項工作的點評和疑問：
本研究原預期目的是希望能夠在模式生物斑馬魚上利用韓春雨的研究工具（發表在NBT雜誌）來研究一個未知基因功能，具體是試圖利用NgAgo工具去解析Fabp11a基因在斑馬魚發育中作用，但是並沒有獲得類似韓春雨在人類細胞中基因編輯的結果（對應的靶基因序列產生In/del）。但是仍然發現少量斑馬魚有表型，在此基礎上，通過進一步研究發現，NgAgo/5"p-gDNA系統可能具有基因表達調節的功能，也就是NgAgo/5"p-gDNA通過knock-down去調節Fabp11a基因的功能。該結果在其他基因中得到驗證。
這個研究蠻新穎的，但是仍然有幾個相關問題可能需要去回答:
1. NgAgo加了核定位信號（NLS），是否一定需要在細胞核中發揮作用？如果把核定位信號去掉，是否也能夠發揮作用？是否一定需要5"磷酸化的單鏈DNA（5"p-gDNA），非磷酸化也會有一樣的knock-down效果嗎？雙鏈DNA效果如何？
2. 利用Fabp11a對應的mRNA進行補償實驗，是否有劑量依賴關係？而NgAgo/5"p-gDNA是否能夠作用Fabp11a對應的mRNA？
3. NgAgo/5"p-gDNA似乎顯示比翻譯抑制工具 Morpholino（斑馬魚研究基因功能的一個工具）對基因的knock-down更有效，這個系統是否在哺乳動物細胞也一樣好用呢？
4. 這個研究提示，NgAgo/5"p-gDNA可能是在轉錄水平起作用的，是否是直接與DNA結合起作用的？北京大學孫育傑教授利用圖像工具研究，發現NgAgo/5"p-gDNA無法結合在靶基因對應的基因組位置（網路上有的），似乎與本研究的提示不一致。
美國克利夫蘭醫學中心從事基因轉錄調控研究某博後點評：作者認為是一種類似於dCas9的抑制作用。但是首先作者沒有顯示NgAgo有直接結合到染色體DNA上的能力。而且dCas9是要和KRAB 融合表達以後才能抑制基因轉錄，dCas9 本身對基因轉錄抑制作用比較有限。這樣需要sgRNA的target 位點在TSS附近，這篇文章的2個guide RNA離轉錄位點有點太遠了。不太可能是通過這種機制。其實做一個pol2 ChIP就知道是否是通過抑制了基因轉錄。
丹麥奧胡斯大學博後蔡宇伽博士點評：
雙十一，劉東研究組在Cell Research發表了一篇非常吸引眼球的NgAgo文章。他們在斑馬魚中觀察到了類似RNA干擾的現象，而非此前廣受爭議的基因敲除。這個現象其實是在意料之中，因為此前，諸多小組在重複韓春雨NgAgo的文章的時候，普遍反應可以觀察到gfp基因表達下調。斑馬魚適宜的生活溫度是28.5度左右，在此溫度下作者沒有觀察到基因敲除。由於NgAgo的活性可能跟溫度有關，為此，作者特意把斑馬魚胚胎放置37度，儘管此時作者依然可以觀察到基因表達下調的現象，但是還是沒有觀察到基因敲除。NgAgo介導的基因表達下調機理現在還不清楚。有可能在轉錄階段，但也有可能是在蛋白翻譯階段。如果NgAgo通過與DNA結合干擾基因表達，那麼即使它不直接切割DNA也可以開發出一些有意思的工具，包括熒光定位及與FokI結合定點切割DNA。
BioArt點評：這篇文章的所有工作都是在斑馬魚中做的，而不是直接重複韓春雨NBT論文中的工作，實驗結果清楚的表明gDNA/NgAgo系統能在體內特異性的一致靶基因的表達，但是不能對基因進行切割，這篇文章雖然沒有在論文中直接表明是支持了還是否定了韓春雨的工作，但是實驗結果清楚的告訴我們gDNA/NgAgo系統至少在斑馬魚中不能夠實行基因編輯，間接的否定了NBT的結果。事實上這個結果並不奇怪，其實最早北大魏文勝教授實驗室的結果也表明gDNA/NgAgo系統在293T細胞中能敲低目的基因而不能實現基因切割，筆者還詢問過曾經在小鼠胚胎中注射gDNA/NgAgo的資深研究人員，他也表示在小鼠胚胎中也有類似的敲低現象發生。所以總的來說，這篇論文的報道並不代表韓春雨老師NBT的工作被證實了，後續可能還需要相關的工作去進一步解釋說明，特別是解釋RNAi的機制是什麼，或許結構生物學能給出一些答案。
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這篇文章有點兒稀里糊塗。他們猜測對rna水平的調控是通過轉錄進行的。按照這個邏輯推測，ago是結合DNA的，但是種種跡象表明，這一點是存疑的。我們通過ago-gfp標記端粒無表型，這個原因是ago不結合或者結合弱。但北京大學分子醫學研究所教授熊敬維則說，他們還構建了 FokⅠ-NgAgo 融合蛋白來研究 NgAgo／gDNA 是否在 293T 細胞中有介導靶基因突變的功能，他們研究了3個靶基因，沒有發現突變，這就詭異啦！如果ago有結合活性而無切割活性，連上fokl就變成talen啦 。所以這篇cell res也是存在問題的。
綜上兩實驗所述，ago對rna水平的影響應該不是通過控制轉錄進行的，可能是通過影響rna的降解或者翻譯過程。
工作概括：
在多個基因中驗證了同時注射NgAgo-ssDNA能夠在不引起基因突變(DNA)的情況下降低基因表達(mRNA)
結論：
在斑馬魚中NgAgo-ssDNA複合體是通過降低基因表達而不是引入基因突變發揮作用，the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene kncokdown in zebrifish（NgAgo系統是一種新的基因敲低系統）
WTF，說好的新一代基因編輯工具呢？
作者進行了一些排除特殊情況干擾的實驗：
A.單獨的NgAgo不行，單獨的ssDNA也不行（排除ASO途徑）→
→
要在一起才有作用，但不能證明是否需要形成複合體，要證明這個，可能還要進行體外結合實驗或者IP-seq。
B.合成與原ssDNA方向相反的gDNA，仍然有敲低效果→
→
敲低效果應該不是作用在mRNA上的。
C.斑馬魚養在28.5℃水箱中，高溫會引起發育異常，然後作者殘忍地嘗試將溫度提高到NgAgo的工作溫度37℃，然並卵；→
→
溫度說，這鍋我不背！
D.對NgAgo進行了去酶活性突變，發現基因敲低現象杠杠的；→
→
根本不依賴NgAgo的核酸酶活性啊，不知道NgAgo是不是還有隱藏其他的神奇能力。
E.反義嗎啉代介導的翻譯阻遏和Cas9介導的敲除都能達到NgAgo/ssDNA相同的表型；→
→
不想解釋了。
所以，這篇文章並不能替韓主席背書，甚至還拍了拍他的光頭……
當然，我們還不能就此完全否認韓主席工作的真實性，畢竟人的細胞和斑馬魚可能不一樣，萬一韓老師養的人源細胞里寄生了什麼畫風清奇、武功高強的細菌呢，或許韓老師最近正在日日夜夜鑽研啊！
夢想還是要有的，萬一實現了呢？我們可以先定個小目標，比如發他個Nature子刊？
今天看到師弟轉的這篇paper，因為是斑馬魚里做的，所以特別關注了一下。
有關這篇文章的中心內容其他回答已經解釋得很清楚了，就是結論是對韓春雨不利的。是否有knockout測序結果才是金標準，沒有突變就是沒有實現基因編輯。但是因為跨了物種不是嚴格意義上的重複，還不足以證實韓NgAgo一定是造假。
如果此文可信，NgAgo特異性識別DNA序列抑制轉錄的機制倒是很有意思，不過看不到任何替代CRISPR的前景，就看哪位大牛有閑錢做著玩玩吧。
呵呵，上面已經講的很詳細了，我打個簡單的比方：
1、韓春雨：我能將水製成油，1升水能制出0.2~0.4升的油，成功機率是90%
2、全世界：按你的方法怎麼制不出任何油呢？油產量等於0
3、Cell Research劉東：水不能制油。水是流體，油也是流體，所以可能韓將黃色的水當成了油。
4、韓粉：韓春雨的技術已被證明可繼續深入，水變油不再是夢，因為水是流體，而且能染黃。
請問這到底是什麼邏輯？阿狗技術能敲低基因（抑制RNA表達）這很意外嗎？很多古細菌都可以做到好嗎？古細菌的這種特性早已成為生物界常識，還需要證明嗎？不需要用這技術來搞斑馬魚，隨便買點耗子葯或者核廢料，控制好劑量餵給斑馬魚，一樣可以讓斑馬魚畸形。
這真是因為核廢料能讓斑馬魚致殘，所以核廢料能用來治療人類癌症的邏輯，對於韓粉的邏輯，人神共畏。還沒來得及仔細看內容，但是看到大家的討論
似乎韓真的像我之前說的那樣，把knockdown當成KO了
這個就真的很尷尬了
附原答案
http://www.zhihu.com/question/50555807/answer/122031603謝邀。
這篇文章直接剛正面說韓你給的方法和條件壓根就做不了gene-editing，你騙我錢財毀我青春。。
以及這篇文章的目的估計就是為了打臉，否則不會一些很快就能做完的補充實驗都不做，卻趕緊發letter。。
我的阿狗已經被cell research正式報道具有功能了。。。。。。
下次接受採訪時韓春雨的回答要點。賭100韓教授會在下次採訪的時候說出：「Cell證實實驗可重複。」
然而事實上這篇文章並沒有證明NgAgo可以產生韓春雨文章裡面的那些效果，反而認為NgAgo無法knockout，即：該篇文章無法證明韓的工作可重複。這點高票已經說明的很清楚了。
那麼說出這句話的人到底是不是芳草天，相信吃瓜群眾們是能看的清楚的。看了Cell Res關於NgAgo最新的報道，似乎能夠理解前段時間那篇paper被加工的路數了：觀察到表型了--卧槽有作用！→趕緊測個序--卧槽沒變化！→卧槽這怎麼解釋啊，要搞清楚敲降的機制需要不少投入啊，沒錢→不管了，強行讓它能切割DNA！強行讓它能解釋表型！→嘿嘿嘿，NBT
這篇文章說用NgAgo和ssDNA注射後，看到了表型，但是機制是抑制了轉錄，靶基因表達量下降了，但是基因自身沒有發生任何突變。注射沒有催化活性的突變NgAgo還是有表型，所以作者推測NgAgo是在阻止轉錄，沒有編輯基因。
作者最後總結如下（這是一篇letter to editor, 總結相當於一般文章的摘要）：In summary, our study shows that gene knockdown is the main mechanism by which gDNA/NgAgo affects gene function in zebrafish. This is supported by results of the experiments using presumably catalytically dead NgAgo. In addition, we have failed to detect any mutation in all the embryos we examined. Since the catalytically inactive (dead) Cas9 (dCas9):sgRNA complex could efficiently inhibit gene expression through binding to the coding sequence, we hypothesize that gDNA/NgAgo may bind to a target gene to block its transcription. Overall, we suggest that the gDNA/NgAgo system provides an alternative strategy for gene knockdown in zebrafish.
文章得出的結果基本和韓在nbt上發的相反，這是要懟正面了啊，好評好評，老闆，再來一車瓜。
韓教授要開始被打臉了（並不心疼=_=）
我怎麼覺得這個文章更加說明韓的基因編輯沒有在斑馬魚里實現呢。
前進一小步就行 我們普通人最喜歡科學家出成果了
仔細閱讀原文可以看出，韓春雨的方法與Cell Research最大的差異是實驗系統的差異，即一個在哺乳動物細胞中，一個在斑馬魚中。其他可能存在的差異也許是實驗操作細節的差異。
此外，作者自身也考慮到溫度因素（斑馬魚的培養溫度為28.5度，而韓春雨方法是在哺乳動物細胞培養溫度37度下進行），並同時在37度的條件下進行了實驗，但僅提到沒有檢測到基因組的突變或鹼基刪除，並沒有呈現實驗數據（data not shown）。
總之，劉東研究組的實驗並不是直接證明，而是側面暗示了韓的方法並沒有如其所宣稱的基因編輯作用。
「中國科訊」微信公眾號針對這件事情剛剛發表了文章，講得很詳細。
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