韓春雨公布的 NgAgo 基因編輯過程修改了哪些地方？會比較好操作嗎？

12-29

Addgene: nls-NgAgo-GK

這麼久回答還這麼少，我簡單說下我的看法吧

1 血清品牌：莫名其妙，可能他沒怎麼用過進口血清覺得高大上吧。只要不是民海那種自帶污染的血清就行

2 293貼壁不牢：常識，無意義

1 TE換成弱鹼性水：因為DNA很穩定，現在實驗環境都變好了，不太真的需要TE來保存DNA，而EDTA又經常干擾酶切反應，所以大多都簡化成用水或者Tris-HCl pH8.0了。Sigma和QIAgen的miniprep都是Tris-HCl或水洗脫。使用TE的實驗室已經成了少數，那麼多重複不出來的不可能都用TE。

2 二次轉染：這是一個實驗室常規方案，並非韓先生獨創，但提升轉染率還有很多方法，八仙過海各顯神通，別把那麼多實驗室都看成傻子

1 支原體：常識+常規

2 細胞培養不用EDTA：這不是培液的常規成分，要有才奇怪了

3 轉染用lipo 2000：常規，3000尚未普及。

4 自己合成pDNA，不可以公司合成：莫名其妙的要求，不是每個公司都像國內某些外包公司那樣不負責任的。倒像是想給試圖重複的人增加一點人為障礙。

總結：這整篇給我的感覺是缺乏乾貨，隔靴搔癢。很多內容像是充數的，寫在給本科生的學生實驗指導中倒是不錯，而不像是給同行專家看的。

韓的新版protocol做了幾處小的變動，但與舊版沒有本質的區別，或許改動的地方早已有課題組嘗試過，比如多次轉染gDNA。（新版protocol下載地址： https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx ）

既然題主問的是「修改了哪些地方」，那我就把修改之處羅列一下（題主的問題不是「這些修改對於實驗（重複性）有沒有影響」，所以我只羅列修改的地方，至於實際效果，等待其他課題組跟進的結果報道）。

韓的新版protocol里分為Cell culture Transfection Genomic DNA
extraction三部分。在Cell culture部分，修改有：

1. 血清品牌由 Hyclone 變更為 Gibco ；

2. 增加了293T 細胞貼壁不牢的提示（Since 293T cells are not firmly attached, be gentle and do not disturb
cells when changing medium.

在Transfection部分，修改有：

1. 溶解NgAgo和gDNA的溶液做了修改：NBT里使用的是0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），新版protocol里改為H2O (pH 8.0,
alkalization by NaOH);

2. 增加了補轉gDNA的建議，原因是提高gDNA裝載到NgAgo的效率 ( to improve the
efficiency of gDNA loading to NgAgo, sometimes multiple transfection of gDNA
helps).

在Genomic DNA extraction部分就沒啥好說的。

在新版protocol中，後面還加了一個注意事項：

1. 避免支原體等的污染 (NgAgo/gDNA system is
extremely sensitive to contamination of intracellular bacteria (including
mycoplasma))；

2. 細胞培養過程中要避免使用金屬離子螯合劑 EDTA，因為NgAgo需要Mg2+ (Because Agos need
magnesium, avoid EDTA when detaching and seeding cells into the plates for
transfection.)；

3. 轉染使用 Lipofectamine? 2000，避免使用 Lipofectamine? 3000 ( since the supplement
P3000 interferes with ssDNA transfection);

4. 自己使用4 PNK (Biolab)磷酸化gDNA，即不要到公司直接合成？磷酸化後溶解到pH 8.0的H2O中 (5" phosporylation of
ssDNA guide by using T4 PNK (Biolab))