NgAgo重複性差的可能原因有哪些？

12-29

＃＃本帖純技術
根據Google Group，MITBBS和知乎上的用戶反饋，很難重複NgAgo對基因組引入Indel的實驗（Figure 4）。本帖立足點是完全相信韓文章中的數據，那麼難以重複的原因可能有什麼？

我拋磚引玉，有點對Addgene上的NgAgo質粒存疑點。根據google group上一用戶上傳的電泳圖和其他數位用戶的反饋來看，未看到任何indel，所以比較懷疑Addgene上的質粒是否編碼有酶活性的NgAgo，甚至不知道是否有表達（不知是否有人做過IF或者western驗證表達、定位）

另外我很不明白原文中為何NgAgo質粒和guide不同時間轉染就看不到任何indel。作者的解釋是新合成的NgAgo才能load guide。但是為何NgAgo只能在很短的時間內表達（8 hr），我的經驗是質粒可以在細胞內存在很長時間，至少幾天是沒問題的。難道是細胞可以快速降解轉入的ssODN？是否有人考慮過用DNAse KO的cell line試試？

我個人不認為對於經驗豐富的CRISPR用戶來說T7E1會出現致命性的問題。
歡迎大家分析。

------------更新 7.6.2016--------------

周馳凱
我們第一次就沒有加gDNA,只是用FLAG 檢測質粒的表達和核定位。NgAGO的表達肯定沒問題。

－－這條信息說明不是轉染的問題（順帶排除細胞密度、血清、質粒），我也不認可T7E1會出問題，所以剩下的問題就是ssODN的質量、in vivo的loading和cutting
ssODN目前來看有兩種途徑獲取，公司合成和PNK磷酸化。前者普遍反映有問題（對於Figure4），後者有人反映初步成功（目前僅對Figure3）。
in vivo的loading是可以通過實驗驗證的，但是估計如果沒有indel，大家沒人想做吧（比如轉染後做IP看gel shifting，或者single molecule colocalization)。
單獨的檢測in vivo cutting或許要在體外先assembe NgAgo－ssODN了

-------------更新7.7.2016--------------------
來自Google Group的消息，直接對比NgAgo和CAS9，NgAgo無任何效果，CAS9正常。說明根據目前已經發表的實驗步驟和公開的材料（質粒），是無法重複出Figure 4的結果的。韓實驗室應該考慮重新檢查自己的實驗記錄了，看看哪些地方有沒有遺漏的。
from: ab...@sanger.ac.uk
In the first attempt, I have transfected phosphorylated oligos (IDT, PAGE purified) targeting the TP53 locus (x2 different sequences) and the Addgene NgAgo plasmid into iPSCs using nucleofection. Despite getting very efficient mutagenesis in a parallel experiment with Cas9 (indels detected by HRMA), we cannot detect any mutagenesis with NgAgo by HRMA.

-------------引用一個------------------------
純從science角度分析一下韓春雨的文章

http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/32021669.html

發信人: yyadam (sunwind), 信區: Biology
標題: 純從science角度分析一下韓春雨的文章
關鍵字: NgAgo；韓春雨
發信站: BBS 未名空間站 (Thu May 26 14:05:06 2016, 美東)

首先要說明的是此文不針對任何個人，只對science。我真心希望韓的文章可以被重複
，而自己也在試著重複。

對於這片文章，我本人有一下幾點疑問，看看那位高人能解答一下：

1.一般來說Ago蛋白C端加tag，無論是來自於那個物種，蛋白就沒有活性了，主要由Ago
蛋白自身結構folding決定。文中用的幾個construct，好像只有1-2個C端是沒有tag的
。那麼，用C端帶tag的Ago作出的實驗，是否有意義呢？當然，不能夠排除NgAgo本身特
殊，能夠tolerate C端tag，只是從預測的結構上講，可能性很小。

2.Ago催化酶切的核心domain實際是一個RNaseH fold，催化cleavage時應該結合雙鏈（
無論DNA或RNA），而雙鏈其中一個是guide，另外一個是target。我無法想像gDNA
guided NgAgo是如何切割雙鏈DNA的。文章開始用2個guide，也許還有些道理（說不定
細胞DNA會有瞬時的單鏈狀態）；後來直接上一個guide也能行，確實比較神奇。當然，
不能夠排除NgAgo本身特殊，就是能夠切雙鏈，只是從其類似蛋白結構上講，可能性很
小。

3.文章說如果同時轉入Ago表達質粒和gDNA，就能行。如果先轉Ago質粒，8小時候再轉
gDNA，就不行。這裡我無法理解。難道先轉Ago質粒8小時候，這個質粒就不表達了？如
果繼續表達，那8小時候再加gDNA跟同時一起轉細胞又有什麼區別呢？難道
transfection效率太低，以至於2次transfect的東西無法進入同一細胞，因而不行？至
少從這個角度來講，文章的一個主要figure的結果有點奇怪。

4. Minor points:文章用bacteria codon 的construct在真核細胞表達蛋白，能有表達
真心不容易。如果用humanized codon，效果豈不更好？文末作者declare no
financial interest，如果這個東西將來有大用途了，還不能有專利呀，太失策了。

希望大家輕拍。

Best,

Andrew

韓春雨博士在百度貼吧上做了實驗要點的詳細說明。

內容如下：
我目前仍只有一個做實驗的小團隊，無法做好服務性工作，一天十幾個個電話我都是重複的以下內容：----所謂高超的技巧，其實也很簡單，細胞做好檢測，不要有寄生菌污染，不要有支原體污染（Ago系統對污染特別敏感---特別是單轉guide假陽性---我非常確定在沒有污染的情況下，單轉guid不會影響GFP表達，假陰性也大多因為細胞污染，假陽性和假陰性我都遇到過，國內買的細胞我就不吐槽了），轉染用的質粒質量要好（可用30ngGFP轉細胞，若是均一且效率高表明質量好，強弱不均一則表明質量差，越不均一表明質量越差），guide磷酸化完全（沒有磷酸化不能load和切割---謝謝印證我的Fig2結果，至於怎麼檢測，自己跑個PAGE看看---），特別的，對於Fig4，也是幾乎惟一算是有難度的，就是控制轉染時的細胞密度和用血清控制細胞生長，時間稍長，畢竟NgAgo未經過系統的密碼子優化---照著online method上protocol for genome editing and T7E1做（小經驗，PCR最好不要有引物二聚體，如果引物二聚體多請重設引物；PCR產物直接回收最好不跑膠回收，可能跟ago切24bp有關，設好對照！）---銀染解析度高，可以排除T7E1假陽性，能做出預期條帶後請用PCR產物去測序--------歡迎大家廣泛使用此系統，並分享成功經驗和失敗教訓。附，addgen上的質粒，可以直接用作基因組編輯。再次強調，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假陽性，是細胞出問題了（謝天謝地不但我自己而且審稿人也有這個對照）出現假陽性的細胞切基因組就沒戲了。對於Fig4，若是不習慣做銀染，也可以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前後加幾個保護性的鹼基---從GFP-N1擴出來連到T-vector上，再從此doner-Tvector上擴（防止GFP-N1污染的假陽性）出來純化，500-800ng共轉（for each well of 24 well plate）。

參考：方舟子：河北科技大學韓春雨「諾貝爾獎級」實驗的重複性問題

我師兄實驗室的情況：fig 3 ok，fig 4沒出來
嚴格按照Han的protocol做的
材料批號也與Han的一致
就差1w轉的離心機了

最近更新：同組的另一位phd的fig4有PCR結果了，已經送去測序。

答主還是等等再說吧，不要著急。

目前各個實驗室的重複進展基本也告一段落了。除非有人真的跟研製原子彈一樣保密，否則能重複出來的人不可能不說的。目前已知的是，沒有人做出Fig 4。

韓春雨事件近期可能有兩種走向，取決於那些重複了Fig 3，並且認為結果很有希望的人，能否做出Fig 4。比如近些天被廣泛報道的印度實驗室，他們表示正在測序中。這樣的人可能還有幾個。如果這些人也驗證失敗了，那麼就基本塵埃落定了。反之，如果有一兩個人宣布成功了，那麼整件事還有得扯皮。

我們實驗室也在重複，首先是體外酶切的結果就重複不出來，轉到293T里測序檢測不到indel，按照韓的說法去除支原體也沒有什麼用，並且也檢測了gDNA磷酸化水平是沒有問題的，依然重複不出他的結果。western檢測到蛋白表達了，但是質量偏大。。。
我看情況不妙啊！

瀉藥，這事兒現在沒啥好討論的了，我賭五毛錢小韓就是造假。本來小韓就是想在著名BBS上灌一貼，完成學校的考核任務，沒想到吹牛逼的力度沒掌握好，吹大了，饒毅不開眼的又聞者味跟過來吹捧。於是事情變得沒法收拾。羅輯思維說的對，NCS上的很多實驗沒辦法重複，但這並不意味著很多論文就是假的。主要的原因還在於那些論文的價值太小，願意重複的本來也沒幾家實驗室。但NgAgo不一樣，劃時代的基因編輯技術，大家都等著重複出來繼續去NCS里挖二道坑。
昨天水木特快上有人吹牛逼說得知上面放話，韓春雨這事情定性為造假，但要冷處理。水木上的水車號稱無所不知，還是拭目以待吧。
我個人的觀點就是：科學容不得半點沙子，一就是一，二就是二，你如果說一在某些情況下也能等於二，那你得先證明了才算數。別跟我說動機，或者陰謀，即使韓春雨沒造假，顏寧的質疑也無可厚非。沒有懷疑精神，我們現在還在原始叢林里光著屁股追著跑

我知道的驗證結論的實驗室，也是fig4沒有做出來。

NgAgo是在65攝氏度有活力的酶，所以韓春雨反抗自然的行為肯定不會成功。

我也覺得好誇張。黃禹錫和小保方晴子還歷歷在目，怎麼可能還會有人造假。
而且，既然是作為一個新的基因組編輯系統發表文章，那韓肯定會想到：無數做crispr的實驗室都會去嘗試他的NgAgo系統。所以，他不至於提一個假的系統出來吧。
但是，最近澳大利亞的科學家也發文說做不出來，看來目前為止就沒有人成功重複出來了。韓說，需要「高超的實驗技巧」、嚴格避免污染。他那麼條件簡陋的實驗室都能做的出來的東西，不肯能世界上這麼多牛x實驗室，不可能沒有能達到他所聲稱的實驗要求的啊。
我等小渣渣，還是繼續做crispr吧；順便圍觀NgAgo的進展。

跟圍棋界的ag一樣，最好的是谷歌的，其他ai都差的很遠。估計韓這個實驗一定保留大量關鍵步驟數據，有意造成其他實驗室不能重複，應該是商業利益太過於巨大了。

希望大家能重複出來,那我等小渣做實驗就方便多了