如何看待方舟子質疑韓春雨實驗不具備可重複性？

12-29

今日，知名科學打假人方舟子公開發文，質疑韓春雨「諾貝爾獎級」實驗成果存在「不可重複複製操作」的問題，暗指韓春雨科研成果真實性不足。好戲開演了！

雖然我也沒用過crispR，就小打小鬧用red系統敲過一點細菌的基因，不過這個技術確實感覺上潛力很大，讀了文章和方舟子的質疑，試著回答一下：

1. 方舟子的質疑是什麼：

為什麼一個新實驗的結果別人都反映重複不出來，原因很多，比如可能是重
復出來的都不吭聲，重複不出來的實驗技術不行，論文中隱瞞了關鍵的「實驗技
巧」（這不道德），或者論文報告的結果乾脆就是編的（這更不道德）。一個新
的科學發現、技術，需要經過別人的重複才得到公認。別人重複不出來，有疑問，
是很正常的。作為首創者應該做的是去消除疑問，而不是攻擊、謾罵，否則那更
讓人懷疑。

方舟子第一篇文章疑問的關鍵點在於不可重複，並沒有說造假，這兩者的差別是很大的，不可簡單地混為一談。論文裡面經常會省略許多步驟，或者寫錯使用的pH值，使用的數據什麼的，這是很常見的，並且確實屬於不道德（也可能是作者覺得都是那樣做的沒必要寫）。

2. 方舟子質疑的論據：
2.1 Figure 4a電泳條帶位置有誤：

論文圖4a是對DNA進行了編輯後產生的不同片段進行電泳的結果。DNA是由一
個個核苷酸鏈接而成的，核苷酸越多，DNA片段就越大。經過剪切之後，圖中的
G6和G13相差30個核苷酸。這個大小差別是不是能在電泳上看出來，取決於凝膠
的濃度和電泳的時間。看圖4a中最左邊的標識條帶，250個核苷酸片段的和500個
核苷酸片段的距離分得很開，估算可知大約相差10個核苷酸以上的條帶就能分開，
因此相差30個核苷酸的條帶應該能夠很明顯地分開，但是在韓春雨出示的電泳圖
中，G6和G13卻在同一個位置，高低一樣，看不出差了30個核苷酸，這就很不合
理。

這張圖還有一個不合理的地方。DNA凝膠電泳的條帶通常平整，但是由於電
壓不穩定或緩衝液用得太久了不均勻，有時在條帶的兩端會出現拖尾滯後的現象。
這張圖的標識一列和樣品最下面的條帶都出現了拖尾，然而樣品第二行的條帶卻
出現了相反的「拖中」（兩端跑得快、中間跑得慢），就像是最後一行往下跑，
第二行往上跑，真是奇怪。

要理解方舟子的質疑，首先要搞懂這個T7 endonuclease I切割實驗的基本意義：
我自己也是經過查詢理解後通俗地解釋一下：
首先解讀電泳圖的基本就是黑色的DNA條帶在膠中的位置指示了DNA的長度，越靠上DNA長度越長。這是基本原則。
對基因組產生切割的特點是在大量的基因組中的一部分基因組上產生雙鏈斷裂（DSB）,隨後修復形成indel。可以簡單地理解成原本都是一樣的基因組現在產生了區別，假設他們是雙鏈M1和W1，他們的兩條鏈分別是F和R。然後通過PCR得到大量目標區域雙鏈，M1F與M1R配對，W1F與W1R配對，此時他們都是分別與完全互補配對的鏈配對。再通過變性使他們分開，就得到了M1F-M1R W1F和W1R，M1F和W1R,M1R和W1F四種雙鏈，那麼前兩種雙鏈是完全互補配對的，而後兩種雙鏈則是出現了mismatch. 而根據T7E1的性質：T7 Endonuclease I 他會從mismatch處切割，因而會切割後兩種雙鏈而不切割前兩種雙鏈，從而使最後得到的雙鏈成為三條長度不同的雙鏈。對應到電泳圖上，就是M1F與M1R， W1F和W1R這兩條DNA長度接近，是最上面最黑的一條帶。而兩個M1F和W1R, M1R和W1F分別對應下面的兩條帶。

自製一張圖幫助理解：

最後切了之後到兩邊的長度不同，產生不同長度的DNA。

（這是CrispR中用T7E1實驗的原理圖，不過根據理解在T7E1的過程應該是一樣的）

又由於guide DNA引導切割位置，那麼在同樣的PCR產物下，G6和G13將有30個鹼基長度的差距。又根據膠圖可以看出500個鹼基的marker之間的距離，雖然電泳不是線性，但是30個鹼基大約是500的16分之一，可見應該是可以分清的，但是圖中G6和G13中心位置並沒有明顯的差別。

注意到G13有些歪斜，可能是靠近電泳膠的周邊有邊緣效應，並且這個膠的點樣量都是比較大的，成團，這些都可能影響判斷，但是從我個人經驗判斷我覺得方舟子這條質疑是有道理的。

而跑膠的拖尾問題，我個人的經驗覺得這個不太站得住腳。我們實驗室的電泳膠是跑的非常多的，見過許許多多奇形怪狀的帶型，另外由於電泳試劑用量大，多數實驗室普遍使用的都是相當廉價的硼酸 Tris鹼等配置緩衝液，根據我個人的配置經驗，抽濾能看到許多明顯的灰塵，對這些廉價試劑的純度都是沒有信心的，這些也都可能有影響，都有點玄學的意思了。有空找一找跑的漂亮的膠和跑得丑出天際的膠貼一貼。這件事也很快有人給方舟子說明了，方舟子也登出來了http://xys8.dxiong.com/xys/ebooks/others/science/dajia17/hanchunyu5.txt
雖然說得是蛋白膠。估計方舟子自己也明白這條力度不大，所以也就是提了一下。

2.2 條帶染色亮度

c和圖一的實驗是一樣的，只是使用了不同的細胞系，根據我前面的說明，下面的兩條帶都是PCR擴增後切割形成，理論上摩爾量應該是一樣的，但是DNA本身並不發光，需要使用染料如EB，花青類染料等進行染色。染色的效率會影響帶的深淺濃度。

僅僅只看fig 4C的話，方舟子的質疑確實站不住腳，我個人經驗是在看圖接近100到200的長度的DNA的擴散並不是很嚴重，染色效率差距也並不是很大。但是和Fig 4b的第一道比的話就明顯顯得確實出現了比較大的差異，兩條DNA的長度都比較接近但是在濃度上明顯出現了較大的差異。

雖然方舟子的質疑都有道理，但是由於電泳膠的配置，染色，染完色後的脫色過程都有太多的隨機因素，這些仍然需要進一步的證實，方舟子的措辭也是比較得當的，質疑的是」重複性問題「。
並推測figure 4造假嫌疑。

　　因此，從圖4a和圖4c的條帶的位置和染色程度判斷，這兩個圖不像是真實樣
品的電泳圖，有兩種可能，要麼是「真的假電泳」，是在Photoshop中PS拼接出
來的；要麼是「假的真電泳」，用假樣品跑出的電泳。而且造假者的分子生物學
水平很差，都不知道怎麼造出一個合乎常理的電泳圖。

　　在我發出《河北科大「韓春雨現象」的真相是什麼？》之後，昨天有人宣稱
已重複出了論文圖4的結果，但要過一周再上傳。即使真的有人重複出來了，也
無法解釋上述電泳圖的不合理之處。我在上篇文章中猜測，韓春雨只做出了圖3
結果，做不出圖4結果，就賭一把，編造圖4結果，指望有別人能做出來。如果真
有人做出來了，不過說明他賭對了。其實發明權應該屬於能重複出來的人，韓春
雨只是提供了一個「思路」。

3. 我的個人看法：
對於科研的分配製度確實存在著很大的問題，韓老師苦幹十餘載，終於有朝一日能看到希望，這值得慶幸，但是不意味著就可以忽視質疑的聲音，有理有據的（容易被忽略的加粗）質疑是任何科研成果的試金石。
尤其對於這種技術類的發現，其重複性和可靠性的要求更是格外的高。
總結就是，我認為方舟子的質疑大部分都是成立的，但是由於科研實驗影響因素過多，還並不足以完全證偽韓老師的論文，希望韓老師能如同方舟子的呼籲一樣，儘快理清原始數據和詳細步驟，給出重複結果，這才是真正的定音之時。

方舟子沒說造假，只是說重複不出來。自然科學的研究中，這樣的質疑很正常的，更何況現在國外數十家實驗室沒有一家能重複相同的實驗，提出疑問，屬於正常的學術討論，沒有任何惡意。

重複不出來，有幾種可能的情況： 1. 實驗很複雜，關鍵步驟或者條件其他實驗室沒有掌握。2. 韓實驗出錯。現在需要韓和其他同行共同討論，儘快讓其他實驗室複製出同樣的結果。

某些韓的支持者，請不要把問題往民族主義上引！
重複不出來那就應該出來解釋，科學的一大特點就是可重複性。
某些韓的支持者就跟某些小鮮肉的粉絲似的，張口閉口你知道##有多刻苦嗎，##發著250度的高燒還在訓練，你們黑他還是人嗎？請記住，科研成果不談情懷，談情懷請出門左拐找羅胖子。
韓老師條件有多苦，實驗條件有多差，人品有多好，這些都不是科學所關注的，關注的只有你的成果的意義以及真實性！
希望韓老師的成果早日重複，不然對國內底層科研界的打擊太大了。

來自方舟子微博的發言:
國際轉基因技術協會主席給會員發信，呼籲不要再浪費時間，金錢和人力去重複韓春雨的實驗，並稱140個重複實驗，70多已告失敗，60多還在驗證中，只有1個聲稱重複出來但結果也相差甚遠。
結果已經很明顯了。

以我多年破別人專利的經歷……
以及重複別人論文的實驗
一般生物實驗重複都十分困難
十個有7-8個都沒影，1-2個大約可行但又達不到報道的水平
完全達到文獻報道少之甚少
因此，這實驗重複不出來，我也覺得沒什麼奇怪。可以看後續文章和其他實驗室的報道相互印證。

題目不妥，方舟子並沒有說造假，而是說沒有人能重複。再說，不能重複不能說造假。

以上答案沒有任何一條答到了點子上。

方舟子根本就不是科學家共同體的一員，沒有資格質疑一線科學家的任何成果，包括小保方晴子
就算是打假，也得專業人士，相關的科學專家，用可靠的實驗來反駁。輪不到方舟子這種「科普人士」來打。方舟子自博士後之後，棄科從文。他所謂的學術打假集中在簡歷造假、職稱造假以及二線、三線的應用層面的打假上。這方面，我姑且算他有一絲髮言權。但在一線科研領域，方舟子從來都沒有絲毫原創性的見解，他在科學家共同體之中也沒有任何話語權可言。可見，他的所謂「打假」實際上是被一線科研人員及科學家共同體所無視的。
那為什麼方舟子還要這麼做？

本質上，方舟子的這些個打假並不是推進人類的理解邊界，而是在普通人面前談至少10年後才有應用意義的基礎科學問題，反正大家都不懂，隨他怎麼亂說都可以，以此來自我炒作。

有沒有方舟子的打假，科研造假也是遲早被發現的，方舟子相當於發動門外漢攪混水。丁肇中博士就說了，如果一個人造假，那麼他遲早會被發現。這個被發現自然是指被科學家同行、科學家共同體所揭發，而不是被所謂的打假鬥士。

評論韓春雨博士是否造假，應當看專業媒體及學術雜誌的跟進報道，應當看生物研究圈其他知名專家及相關人士的見解，而不是方舟子這類江湖打假鬥士。

這才幾個月時間，就想重複別人的結果？

化學、生物實驗，條件極其之多，坐實驗的需要把每一步的條件和操作仔細紀錄下來。即使是這樣，有時候自己都重複不了自己的結果。因為有的時候一個小因素，比如濕度，當時沒覺得這個數據重要，就沒紀錄這個參數。等下回做實驗的時候，濕度變了，就怎麼也重複不出來了。但這並不意味著造假。

寫論文的人，說實話，以個人推測，十之八九會故意省略掉一兩個條件，以讓後來人不能重複，或者要花更多的時間來重複，以保持自己的領先。比如實驗時做攪拌了，有可能列出攪拌的速度，但故意把攪拌的時間不寫出來。審稿人也不一定能注意到這個細節的重要性，投稿時也不算違規。這都是正常的手法。因為，雜誌要看的是最新的結果，投稿人也沒有義務把所有過程全部列出來。再說，要把所有條件全部更出來，事實上也是不可能做得到的。

這個問題中那麼多「圈內人士」能學生物真是大學擴招的惡果。

某些人說方舟子的文章沒有明確說韓春雨造假，但我讀了那個文章以後，發現裡邊每一句話每一個字都在引導讀者相信韓在造假——這比明說韓造假具有更強的殺傷力，還給自己留了餘地——方舟子在這一方面也可以申請專利了！
現在的情況是有部分機構還沒有做出重複的結果來，這在事先已經想到——從之前的一些文章來看，實際上有不少人考慮過韓這個路子，但失敗了，而韓成功了，那麼說明試驗中可能還是存在一些難點！
剛剛在小木蟲上看到一句話，疑是韓的回應，指出了別人試驗失敗可能的原因。我覺得試驗重複出來是早晚的事情！
同樣的，前邊有人指出方舟子可能出於某種目的（比如crispr商業化的需要）寫了這篇文章。我現在感興趣的是，如果有重複性的結果出來了，方是否會向發這篇文章一樣發一篇道歉聲明，要知道方可重來沒有解釋清楚為什麼接受了那麼多外國人的捐款！

現在韓春雨不得不撤稿了，諸位挺韓罵方的有沒有感覺到被打臉？

生物實驗最後給雜誌社的數據都是有選擇性的，有的實驗就是重複不出來，但不能說是造假，有可能是假陽性，雖然好多論文裡面會註明說實驗重複了三次，誰知道重複了幾次，也有可能重複了五次，只挑了最好的一次來發文章。

韓的這篇文章正好是處於基因編輯這個熱點問題上，做的人非常多，大家都會做這方面的實驗，而有的論文，雖然影響因子很高，但做的人也少，重複不出來，也沒多少人知道。

以前在經濟學人上也有過類似的文章，說生物實驗的重複性問題。
[2013.10.19]How science goes wrong 科學哪兒出了問題？

方舟子的質疑不管對不對，都沒有必要咒罵他。質疑是每個追求進步的人終身不可廢棄的品質。

實踐是檢驗真理的唯一標準

我希望韓的科研結果是真的，但我說了不算，方舟子說了也不算

如果韓最後自己都沒有辦法重複實驗，那就很遺憾了

不過誰又知道今年不成功，明年會不會突然想到漏了點什麼又成功了呢

研究成果的可重複性一直是一個大的問題。現在很多文章的研究成果重複不出來。有的是的確因為實驗存在造假，而且有不少中國人，可見大量的低分數文章。另外有些則是以其他實驗室的人力根本沒有辦法重複，還有些是人家發文章故意不告訴你一些關鍵的步驟，也會故意把一些東西寫錯。他方舟子也就是欺負一下沒什麼背景的韓春雨老師。那麼多院士的文章也同樣存在可重複性的質疑，怎麼不見他方舟子去質疑的？大家就坐等一系列應用韓春雨老師技術的文章誕世，然後組隊打方舟子的臉。對了，前面說韓春雨老師沒什麼背景的說法不太正確。前一段李克強總理還專門高度讚揚過韓老師的研究成果。如果你方舟子真的是為了科學而質疑，那你就繼續堅持吧。如果是想賺眼球，通過裹挾民意來給自己貼金，還是趁早閉嘴吧。

當看到有人說能重複出來時，方的反應很詭異……

賭博式打假，很可能摘了個爛桃。看方舟子最近幾天連續高速過彎，簡直醜態百出。

注意時間順序…