翻譯時如何確保選擇正確 tRNA？

12-24

蛋白質合成的時候，為什麼總有相應的trna在核糖體上？trna怎麼知道帶的氨基酸對不對？

這個問題其實想到了很數人忽略的一個要點。
在中學生物學，甚至是本科生物學，標準答案都是「鹼基互補配對」。這個答案其實不太經得住推敲。

鹼基互補配對，是說攜帶氨基酸的tRNA上面三鹼基的反密碼子與mRNA上面三鹼基的密碼子互補配對，從而選擇得到正確的tRNA。

暫時不考慮簡併的情況，試想，如果只有一個鹼基發生了錯配，會有什麼影響？
這個要考慮能量的差異，也就是說，三鹼基配對的自由能變化 $Delta G_{3bp}$ 和只有兩個鹼基配對 $Delta G_{2bp}$ 之間的差異。這個差異非常小，只有~5.5kJ/mol，在這種能量差異下，對tRNA的選擇大約會有1%的錯誤率。一般的蛋白質平均有幾百個氨基酸，那麼，如果核糖體真的是單純依靠鹼基互補配對選擇tRNA，那麼蛋白的錯誤率是非常高的，幾乎沒有蛋白能夠完全正確的合成出來。這種情況下，蛋白質的成品率過低，即使存在質量控制，也很難得到具有正確序列的蛋白質。

與此對應的，實驗測定的核糖體的錯誤率小於0.01%，遠遠小於鹼基互補配對的能量差異所能達到的值。

實際上，鹼基互補配對是一個被過分應用的概念，很多時候鹼基互補配對是一個基礎，但是並不是最重要的決定因素。DNA合成的發生錯誤的概率大約是 $10^{-6}-10^{-8}$ ，而鹼基互補配對的能量差異同樣是小的可憐，只能保證大約1%的突變率（DNA合成之後會有額外的校對和修復，能夠達到 $10^{-9}$ 的突變率，這裡只考慮DNA聚合酶合成DNA這一步的準確率）。這個如果只考慮鹼基互補配對的話，是完全無法解釋的。

保證生物系統極高準確率的核心，在於結構而非序列。
就像生活中的很多例子一樣，如果一次操作準確率不能保障，那麼可以二次篩選。對於tRNA選擇問題來說，生物體是先從眾多tRNA中挑選一個，然後再從選中的tRNA中再選一遍，每一次挑選中，挑中錯誤的tRNA的概率都是能量差異決定的1%，兩次挑選之後就變成了0.01%。

那麼，怎樣實現多輪挑選呢？

必須要保證，任何反應物（tRNA）只有通過了第一輪篩選，才能進入第二輪。在微觀世界，這種方法只有一個，就是利用額外的能量輸入。這個問題最早是Hopfield在1974年解決的，他提出了kinetic proofreading的概念，並發表在PNAS雜誌，隨後Ninio在1975年又作出了額外的闡釋。

By Boumphreyfr (Own work) [CC BY-SA 3.0 (Creative Commons) or GFDL (GNU Free Documentation License v1.3
- GNU Project)], via Wikimedia Commons

具體到核糖體選擇tRNA上面，核糖體選擇tRNA的過程，可以表示成下面這個結合反應
$T + R leftrightarrow TR$
T是tRNA，R是核糖體。
所有的tRNA都是非常相似的，那麼不同的tRNA結合到核糖體上面的速率是近似相等的，也就是
$k_{on}(T_{right})approx k_{on}(T_{wrong})$
但是由於結合能量的差異（只有兩個鹼基配對的結合不如三個鹼基全部配對的結合緊密），解離速率有所不同，即
$k_{off}(T_{right}) < k_{off}(T_{wrong})$
如果tRNA在結合核糖體之後，核糖體立即催化肽鍵的生成，即
$T + R leftrightarrow TR ightarrow R+P$
P代表新生的蛋白質。那麼，錯誤tRNA被裝配的概率就是能量差確定的1%
但是，如果核糖體不是立即催化多肽的合成，而是等一段時間。而且保證，在等待的時間內，新的tRNA不能進入核糖體，但是現在結合的tRNA可以離開核糖體，即
$T + R leftrightarrow TR ightarrow T+R$
最後一步解離是單向箭頭，那麼，由於解離反應的速率差異，在等待相同的時間之後，正確的tRNA的比例會大幅上升。

By Plot-exponential-decay.png: PeterQ derivative work: Autopilot (Plot-exponential-decay.png) [CC BY-SA 2.5-2.0-1.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5-2.0-1.0), CC-BY-SA-3.0 (Creative Commons) or GFDL (GNU Free Documentation License v1.3
- GNU Project)], via Wikimedia Commons

這張圖來自wiki，解離反應近似是指數衰減。如果把橫坐標看作是時間，那麼縱坐標就是這一時刻仍然保持結合的比例。如果把圖中的紅線當作是正確的tRNA的解離曲線，綠線當作錯誤的tRNA的解離曲線，那麼可以看到，隨著時間推移，在每一個橫坐標（時間）上，紅線的縱坐標對綠線的縱坐標的比值在不斷上升。回到核糖體上，就是隨著等待時間的延長，存留下來的tRNA的正確率在上升。

當然，這種等待也有副作用，很多tRNA，即使是正確的tRNA，也都離開了；但是只要再從頭開始結合就可以再繼續合成反應，這樣合成蛋白質的效率變低了，但是正確率大大提高。

那麼如何保證核糖體，暫時不合成蛋白，不再接受新的tRNA，同時還能讓現在tRNA自由解離呢？
生物體使用了幾個稱為為EF的蛋白，這個蛋白做的事情很簡單，就是結合到tRNA上面，把tRNA送進核糖體。核糖體的結構保證了tRNA自己進不去，必須要EF協助才能進入，這樣就保證了不會有tRNA不請自來；EF會緩慢的水解GTP，在GTP沒有被水解之前，EF抑制核糖體的進一步合成；而水解GTP的這段時間就是核糖體的等待時間，tRNA可以隨時解離。當GTP水解之後，EF發生構象變化而離開，核糖體合成下一個肽鍵。這整個過程由於GTP水解釋放了大量能量，因而是不可逆的。

所以，鹼基互補配對僅僅是提供了一個最基礎的區分，但是正確率最重要的決定因素，是EF上面GTP水解的速率。從指數衰減曲線可以看到，GTP水解越慢，正確率越高；但是如果GTP水解過慢，正確的tRNA也會大量解離，降低合成蛋白質的效率。生物體就是在正確率和反應效率之間取了一個折中。
從這個裡面也可以看到，蛋白合成的速率實際是由GTP水解速率控制的，雖然GTP水解並不直接參与催化肽鍵的形成。這樣就給了進化一個機會：影響正確率的突變，並不會直接干擾合成反應，於是這兩個步驟可以在一定程度上獨立演化。

對於DNA複製和RNA轉錄，類似的過程也在進行，這些酶的催化效率都遠沒有達到化學上可能的最高速率。值得一提的是，在細菌中，由於RNA的轉錄和蛋白質的合成是同時進行的，蛋白質的合成速率成為了整個基因表達裡面的限速步驟——只要RNA轉錄速率不慢於蛋白合成就不算拖後腿。而RNA轉錄越慢，mRNA的正確率越高，所以在細菌中，RNA聚合酶的延伸速率和核糖體合成蛋白的速率是幾乎一致的。

Kinetic proofreading幾乎被用到了生物體內所有需要甄別相近的分子的步驟中。DNA複製，RNA轉錄，tRNA合成，蛋白質合成，T細胞識別抗原，SRP識別信號肽……而這一切的準確率只需要微調一個獨立於反應本身的速率常數就可以調控，足見進化之神奇。

想要牽扯到kinetic proofreading的生物過程的更加詳細的闡釋，還是去讀下面這些原始文獻吧！
1. Ninio, Jacques. "Kinetic amplification of enzyme discrimination." Biochimie 57.5 (1975): 587-595.
2. Zhang, Xin, et al. "Sequential checkpoints govern substrate selection during cotranslational protein targeting." Science 328.5979 (2010): 757-760.

I.
如果說你要一個高中知識層面或者大學本科低年級層面的答案，你可能就要失望了。因為tRNA靠的就是鹼基互補配對來識別的：

就像圖中右邊的一樣。

不要小看鹼基互補配對，DNA的複製也是通過類似的方式完成的，而且效率絕對不差。例如大腸桿菌，翻譯的速度可以達到60鹼基/秒。

II.
如果你需要一個更深入的答案，我會再加一樣東西進去：elongation factor（我們假定討論的是在延伸過程中tRNA的識別）。在原核生物中的EF-Tu和真核生物中的EF-1均會幫助tRNA識別mRNA。如下圖：

看見那個抱著tRNA的 EF-Tu 了嗎？它會從一堆tRNA 中間挑選最合適的，然後安插到mRNA上。同時它也會對此進行校對，只有在正常情況下它身上的GTP才會水解為GDP並離開，如果說出了岔子，那麼就推倒重來（其實在GTP水解之後還有一次校對機會）。

III.
如果說以上答案還不能夠滿足你，你繼續問道：哎呀，那EF-Tu怎麼知道哪個tRNA是正確的呀？那麼恭喜你這是一個研究生水平的問題，因為目前還沒有人知道具體的原理。簡單來說：EF-Tu認為，與mRNA互補的那個tRNA是正確的。（這不廢話嗎？說到頭還是鹼基配對）
有兩個說法值得一提：1. EF-Tu對不同tRNA的親和性有微妙的差別，這導致了其選擇性；2.tRNA和EF-Tu結合的時候是「彎的」（注意看圖，真的是彎的），在這種情況下，tRNA雖然能實現鹼基配對但是並不能真正地繼續蛋白合成。只有配對正確，EF-Tu的GTP水解之後，tRNA才會「變直」，蛋白質合成才得以繼續。如果說配錯了，呵呵對不起重來吧。

IV.
最後一個如果，如果你依舊不屈不撓，問我：哎呀，那EF-Tu怎麼知道這個鹼基配對是不是正確的啊？那麼我只能再加上一件東西：核糖體！
最初我們眼中的核糖體是這樣的：

而實際上更確切的，它是這樣的：

看到那些灰色的嗎？那些是啥？那些全是RNA啊，核糖體一大半都是RNA而不是蛋白質！RNA意味著什麼？一大堆氫鍵！

所以說，我們最初理解的鹼基互補配對是這樣的：

但實際的環境是什麼樣的呢？是這樣的：

APE就是三個tRNA結合位點了。他們周圍是成堆的RNA啊！那麼其實我想表達的是下面這張圖：

沒錯，rRNA與這對互補的密碼子之間的氫鍵能夠幫助其決定這個配對是否正確（哦當然了還有兩個鹼基之間的，不過這隻有他們倆自己知道）。

--------------------------------------------------------------------
說了半天廢話，其實就是四個字：鹼基互補。請不要打我。。。。

圖片來自：
[1].Molecular biology of the cell, 5th ed.
[2].Sasikumar, Arjun N., Winder B. Perez, and Terri Goss Kinzy. "The many roles of the eukaryotic elongation factor 1 complex." Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA 3.4 (2012): 543-555.
有能力請去讀第二篇文獻，講的很深入。

哎喲喂.. 這不是我的研究方向嘛 = =...

樓上回答了問題的第一部分，tRNA 是怎麼配對的。

第二部分我來....

答案是 tRNA 本身並不知道連接在上面的氨基酸是不是正確的.

Translation 的步驟是， mRNA 和載有氨基酸的tRNA 進入核糖體， tRNA把3" 的氨基酸卸下來，然後自己被釋放出去.

在tRNA 進入核糖體之前，有一種酶（aaRS）負責把正確的氨基酸連接（amino-acylation）到 tRNA 上面.

值得注意的是，通常情況下 aaRS 跟這個tRNA 是成對出現的，就是說 aaRS 會負責把正確的氨基酸連接到 tRNA 上面，特異性非常高。在這個過程時候，載有氨基酸的 tRNA 就會帶著這個氨基酸進到核糖體完成 translation 後面的步驟。

那麼重點來了，如果這個tRNA 載了一個錯誤的氨基酸進到核糖體，會發生什麼？

答案是，這個氨基酸會被正常地安插在肽鏈裡面。

換句話說，如果想在肽鏈裡面安插非天然的氨基酸（unnatural amino acid），只要劫持 tRNA 掛載氨基酸的步驟就能實現了。

有一個關鍵點在於，劫持的這個 tRNA 必需是正常的蛋白合成中非常少用的，因此現在常用的是 amber codon （琥珀密碼子 UAG）。這個 codon 是三個 stop codon 裡面最少出現的，只要在目標蛋白的基因裡面相應的位置安插這個 codon，就可以把非天然蛋白安裝進去了。

劫持 tRNA 掛載各種氨基酸的辦法有很多.. 用 engineered enzyme 或者用 chemical synthesis 的。

Enzymatic 的我了解的不深入.. 比較多的是稍微改造一下 aaRS 的 active site。舉個栗子，本來掛載 Phe 的 aaRS 稍微改造一下讓 (4-F) Phe 也能做底物被掛載上去。

化學合成方法的文章可以去拜讀 U Virginia 化學系 Dr. Hecht 或者 Sripps Dr. Schultz 兩位大神的paper們..

Hecht lab 已經可以很成功的將非天然的氨基酸連接在 tRNA 上面，安插在某個酶的active site裡面，研究活性區別。（實際過程如下圖）

=================================================

圖片Reference：
1. http://www.accessexcellence.org/AB/GG/genetic.html

2. Duca, Maria, et al. "Synthesis of bisaminoacylated pdCpAs and tandemly activated transfer RNAs." Bioorganic medicinal chemistry 15.13 (2007): 4629-4642.

----------------------------------
如果這個回答能讓我的實驗早一天成功就好惹 T T

第三部分我來.........

細胞質裡面什麼tRNA都有，全都擠成一鍋粥，而選擇性的原因確實是鹼基互補，在於氫鍵帶來自由能改變, 化學平衡向互補鹼基傾斜。不過僅僅三個鹼基配對的自由能變其實挺捉急的，所以翻譯沒那麼精準，其實有點亂七八糟的。但也沒有什麼更好的辦法，無數的生物各種突變了幾十億年也沒試出來一個更好的可行方案。

結果就是一來自然選擇演化出了簡併密碼子來彌補大部分錯配的情況，就是說一個密碼子中錯了一個鹼基經常不改變合成的氨基酸，而終止信號也有三個候選人。

二來即便如此最終產生的蛋白質大約30%是有錯誤的，所以proteasome一直都很忙......事實上細胞層面ubiquitin-proteasome體系一出問題就是大問題。
"As many as 30% of newly synthesized proteins in eukaryotes might undergo degradation within minutes of synthesis" (Alfred L. Goldberg. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature 426, 895-899. 18 December 2003.)

ps: proteasome怎麼翻譯來著?

第四部分我來。。。樓上都說的很好。(遁逃)

一二樓答案已經非常棒了，在這裡我再補充一下。手機打東西少沒有圖
翻譯起始大多數生物靠甲醯甲硫氨酸與起始密碼子AUG結合，之後通過核糖體進行鹼基配對。EF-TU因子會與氨基酸結合成aa-tRNA.EF-TU.GTP複合物，從而完成氨基酸鏈的延伸。EF因子結合除起始甲醯甲硫氨酸以外的全部氨基酸，進而輔助翻譯過程的進行。

首先支持高票答案們，然後這裡想由基因學角度出發補充一下。

首先，有一個叫redundancy的現象也可以確保翻譯時的穩定性。這個現象簡單來說就是不同的密碼子（尤其是第三位不同）依舊可以翻譯出相同的氨基酸（比如cua,ucu,ucg,ucc，uua,uug翻譯出來都是leucine) 這是因為4^3=64遠大於20個氨基酸+開始結束碼。

此外，就算翻譯錯誤了也只有很少的一部分會表現出性狀。chromosome上只有2%是有效coding的encode gene,其餘均為junk gene。這裡有不同假說解釋這些non coding DNA的潛在用處（c-value enigma)

所以，轉錄翻譯雖然精確然而卻並不是完全一成不變的。這些極少發生的error在長期的發展中慢慢演化成了大量的mutation，推動了物種的發展與演化。當然這一切都是建立在高度準確的前提下。

翟中和《細胞生物學》第四版 P268

問的問題，和所回答的答案。一不小心就暴露了自己的身份（eg：高中生、本科生、研究僧、PhD)

剛開始看到這個問題，我在想，翻譯和tRNA有什麼鬼關係，下一瞬間我就問自己「你高中學的是文科嗎?」

哎，樓上說的都很好，解釋的太複雜了，比如說，在表達蛋白的時候，（想像一些人體的蛋白合成）或者是在體外表達蛋白（目前體外表達技術也已經相對成熟了常用原核表達或真核表達根據自己的下游應用）整個大的環境適合表達蛋白的轉錄翻譯機制一般都是循規蹈矩的按照鹼基互補配對的原則，沒有什麼極端物理化學因素影響，一般都是不會錯配的吧。。

數學是火，點燃物理的燈

你可以去看看tRNA的二級結構的特徵，3末端的CCA-OH,和一個氨醯基tRNA的識別部位。這兩個部位保證了tRNA和氨基酸的特異性結合。好像是這樣

molecular biology of the gene WATSON爺爺你值得擁有(是叫這名字么╮(╯▽╰)╭)