實驗室是如何分離生物病毒的？

11-29

@趙世奇謝腰~~~~
我們實驗室比較原始我就說點原始的方法另外這是我們獸醫界的干法人醫界怎麼玩的我不知道
舉例要從病豬/雞上分離病毒（分離過程中要注意的生物安全事項不贅述）
首先通過臨床診斷判斷大致應該是什麼病
比如如果豬嘴巴舌頭腳丫子出現水泡，並且豬群中發病率很高，基本上就是口蹄疫沒跑了

.口蹄疫的特徵病變

如果出現雞出現呼吸有啰音拉綠色稀糞大量急性死亡剖檢見腸道瀰漫性出血等癥狀就可以懷疑是高致病性禽流感或者是新城疫
額以上只是舉個栗子具體的臨床診斷顯然會更複雜

診斷之後取病料如口蹄疫就取水泡皮水泡液，禽流感就取泄殖腔拭子豬流感取鼻拭子
當然拿已經剖檢的動物的含毒量高的內臟去分離病毒成功率會更高比如拿雞肺/腸和豬肺來分流感

另外也可以用實驗室手段（ELISA、測序、膠體金等）先檢測出含有哪些病毒再分離

拿到病料之後先處理一下如果是內髒的話需要研磨把病料用青鏈黴素處理防止細菌污染

然後拿處理病料樣品接種細胞或雞胚，每種病毒都有相應的細胞來進行病毒分離
如口蹄疫對應BHK21細胞（幼倉鼠腎傳代細胞）
藍耳病（豬繁殖與呼吸障礙綜合症，PRRS）對應Marc-145 （綠猴腎細胞）
流感病毒對應MDCK（馬丁達比犬腎上皮細胞）或雞胚（受精的雞蛋，可以看作一枚大細胞），雞胚還能用於分離新城疫等病毒

接種了病料的10日齡雞胚

接種一定時間後（通常是48-72H，但是像禽白血病等病毒會要更久）
通過顯微鏡看細胞病變進行初步鑒定，流感或者新城疫等可以凝集紅細胞的病毒更好辦，拿雞/人等動物的1%紅細胞懸液去與細胞培養液上清/雞胚尿囊液進行血凝實驗就行

血凝實驗（HA）

PRRSV在Marc145細胞上產生的病變

如果此時沒有出現細胞病變的話，有可能是病料中帶毒量過低，通常繼續盲傳三代（即收取初代的細胞培養液/雞胚尿囊液等繼續接種細胞/雞胚，如此往複3次）

在出現這些現象之後就能初步判定分離到了病毒，另外有的病毒不會產生細胞病變，就只有盲測了
此後應進行進一步的實驗室檢測以確定究竟分離到的是哪種病毒及病毒的亞型
比如如果病料接種雞胚後48小時收取的雞胚尿囊液具有血凝特性，我們就會用血凝抑制實驗（簡單說就是讓病毒與相應抗體結合以抑制其血凝活性）來確定是不是流感，及流感的HA亞型。另外也可通過核酸檢測、間接免疫熒光或ELISA等方法來確定

在有的情況下，分離到的病毒並不會只有一種（如豬同時感染了兩種亞型的流感病毒），這時候還需要通過蝕斑實驗或者抗體中和接種等方式來純化病毒。

如果到最後還是沒有分離到病毒，應考慮臨床診斷和實驗室診斷是不是出錯了，病料採集是否正確，是否沒有冷鏈運輸，分離病毒用的細胞株是否恰當，以及是否碰上了未知病毒等等。

在實驗室隨手寫的不嚴謹之處請見諒- -

圖片均來源於網路- -

我混跡的實驗室其實不是研究病毒的，所以我諮詢了一下我們病毒實驗課的助教學長。

首先，病毒，尤其是能夠感染人類的病毒並不是你想要就能要到的，國家相關的法律法規此是有嚴格規定的；同時，也有一些相關機構對此進行監管。一些烈性病毒和樣品是嚴禁外傳的。學長所在的實驗室是因為是傳染病檢測平台才能夠從醫院中獲得樣品。基本上，只要是醫院裡有該病毒的感染者，他們就可以拿到病毒樣品進行分離。這也是為什麼他們實驗室中至今沒有大名鼎鼎的 H7N9 病毒的存在，因為武漢地區還沒有感染的病例啊……

病毒分離的過程大致是這樣的：

1.醫院首先會對感染病毒的患者進行診斷，診斷的手法大概就是觀察病人的癥狀、檢查病人的一些生理參數、以及藉助一些儀器吧，具體的我也不太清楚；

2.在初步確診之後，醫院會從病人身上取得一些樣品，如糞樣、痰樣、咽試樣等，送到實驗室。

3.之後的步驟和 @譚大毛所說的就基本一樣了，就是將樣品進行一些必要的處理後加到細胞中去進行盲傳，根據不同的病毒有不同的宿主細胞核不同的盲傳代數。然後根據 CPE 效應或者 PCR 結果來判定是否有病毒，然後傳代分離純化。

問了幾個實驗室，發現沒幾個是真的需要分離病毒的……現在對於病毒的基礎研究多是在基因或者蛋白的水平上進行，只需要知道病毒的基因組的序列就行了，活病毒研究反而不多。

嗯，插個小段子：天下病毒千千萬，偏偏我抓到的第一個同學，他所在的那個實驗室研究的是 SARS
病毒，SARS 病毒啊，我是要有多人品……

（：是這樣的，因為之前有一個科研人員在對 SARS 病毒進行操作的時候，不慎感染，並最終死亡。國家因此出台了相關政策，一般的科研機構是不允許持有 SARS 活病毒的。
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科技部強調SARS研究要堅持「五必須」「五不準」
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幾個概念：

1.盲傳：本概念一般是用於分離樣本（血清、體液等）中的微生物（主要是細胞內寄生的，比如病毒）。取一定量的血清，接種某種細胞，培養7天，無論上清中有沒有微生物（如病毒），都取該上清，繼續接種這種細胞，如此循環幾次，就稱為盲傳幾代。

鏈接：【求助】細胞培養中的盲傳是什麼意思？

2.CPE 效應：細胞致病效應的縮寫，樓上說得很詳細了。

鏈接：細胞病變效應_百度百科

3.PCR ：天下 PCR 基本都是如出一轍，選用不同的引物、不同的程序就可以滿足各種目的。用來堅定是否分離出病毒的 PCR 無非就是以病毒上的某兩個位點設計引物，以要檢測的樣品作為模板，看能不能 P 出特異性條帶。

寫得有些簡略，權當拋磚了，希望有混跡於病毒實驗室的知友給大家進行分享。如果大家有什麼疑問的，也可以在評論區與我交流，我能解答的我會盡量解答，不能解答的我也可以代為諮詢，畢竟我能接觸到的奮鬥在一線的科研人員還是比較多的。

謝 @殷曉波波爺邀~

上學期剛學完微生物怒答一記～
病毒的實驗室分離主要有三種方法
一、動物接種
一般常用的動物有兔、鼠、猴、犬、牛等。在早期研究病毒主要通過動物接種，目前僅在研究病毒致病性及確定病原或進行疫苗及新葯評價時才進行動物接種。接種途徑有鼻內，皮下，皮內，腦內，腹腔及靜脈等。
但是動物接種成本比較昂貴，比如肝炎病毒最適合接種的動物是黑猩猩，但是其成本太高，老師說飼養條件跟人差不多，因為對實驗動物要遵守人道主義.......這裡就不上圖了，可能會有些殘忍...
二、雞胚接種
雞胚與雞蛋是不一樣的，雞胚是已受精的卵發育成的雞的胚胎，比普通雞蛋要大一些，也貴一些。
有些病毒，如流感病毒、痘病毒和腮腺炎病毒等可在雞胚中進行分離培養，如圖

接種後觀察雞胚活動與死亡情況，取尿囊液或羊水進行血凝實驗測定病毒。
簡單介紹一下血凝試驗，病毒的結構分為核心和外衣殼，核心為核酸，即DNA或RNA，外衣殼為包裹在外的一層蛋白質，上面鑲嵌有一些表面抗原，其中，HA抗原即是介導血凝反應的抗原，又稱血凝素。關於血凝試驗第一個回答中已貼圖，不再重複。
三、細胞培養
將離體活組織塊或分散的組織細胞在培養瓶內生長，接種病毒後進行分離鑒定，是目前最常用的基本方法。用於培養病毒的細胞有三種：
1.原代細胞：指來自動物、雞胚或引產胎兒的組織如猴腎細胞、雞胚細胞或人胚腎，直接用蛋白酶消化獲得。據老師描述...在雞胚即將破殼而出的時候（是的我也覺得這個形容非常千鈞一髮...)把它取出來，用剪刀剪呀剪，然後用蛋白酶液消化，得到的就是來自雞胚的原代細胞。由於原代細胞對多種病毒的易感性高，故主要用作從標本中分離病毒。
2.傳代細胞：傳代細胞系是指可在體外連續穿代的細胞，大多數來自腫瘤組織或二倍體細胞，這些細胞系的染色體與正常細胞不同，為多倍體，所以不能用於研製疫苗，只用於分離病毒。
3.二倍體細胞：二倍體細胞是在體外連續傳代50-100代後仍保持其二倍染色體數目的細胞，這是一個生物學上的定義。這種細胞株多數用人胚肺組織建立，既可用於分離病毒，也是人用疫苗生產中首選的細胞株。以上都是分離方法，至於CPE等都是後續的觀察，不再敘述。

第一次試手，求指教。
病毒對宿主是有嗜性的，分離特定種類的病毒首先需要可以允許其侵入並複製的宿主，從單一種類的細胞群到實驗動物。實驗動物的話通過反覆在其體內傳代可以提高病毒的毒力，不過沒做過不了解了，只好說說細胞傳代。通常在傳代前要考慮到宿主細胞、病毒樣品（各種體液、組織塊啊）、病毒感染劑量（已知時可用TCID50作參照，未知時就得做個樣本梯度稀釋了然後選最佳的那個）、病毒量檢測方法（又分為活病毒檢測和病毒成分檢測），還有就是檢測的間隔時間，一般慢病毒每隔一段時間收集細胞培養液檢測，烈病毒就要注意了，會有很快的細胞病變效應。細胞感染病毒後代謝會變快，也要適時的加入新細胞維持病毒工廠的正常運轉。
病毒分離可以說上一千零一夜，事實上病毒在細胞內傳代已經有了相對固定的流程和步驟，推薦一本《cuurent protocals in immunology》入門，涉及到生物安全、動物倫理啊、實驗操作介紹的都很詳細。有需要的可以搭訕我，休息日還在實驗室一個人真是好凄涼啊。

分離病毒第一步：採集樣品：尿液，唾液，病變組織等
第二步：處理樣品：稀釋，勻漿，生理鹽水抗生素等處理。
第三步：將處理好的樣品接種於病毒敏感細胞或者動物：例如MRC5,VERO,BHK等細胞，或者接種到易感動物體內。
第四步：通過細胞病變效應， PCR，血凝，ELISA等手段檢測病毒是否複製繁殖。
第五步：收穫病毒
第六步：重複3，4，5步以擴增和純化病毒（單克隆化）。

我來答一下工業上的蛋白病毒疫苗是如何被分離出來的。

首先，並不是所有的病毒都在同一種宿主體內培養，我們需要大腸桿菌，酵母菌等多種小動物幫我們生產。我們知道病毒由兩個部分組成，衣殼蛋白和遺傳物質。作為常見的疫苗來講，我們只需要衣殼蛋白而不需要DNA，RNA讓他們在身體內複製。所以我們就會告（qiang）訴（po）大腸桿菌，我們需要這種蛋白啦。通過基因修飾的方法控制了大腸桿菌，這時候聽話的細菌們就開始沒日沒夜的給你幹活，給你產生病毒蛋白。
最後的最後，你需要做的就是他們都殺了，通過離心和過濾的方法，得到你想要的蛋白，甩掉不想要的屍體。

這時候問題來了，屍體辣么多，成分辣么複雜，科學家們是怎麼知道你想要的蛋白質是不是分離出來了呢，這時候你就需要……噠噠噠……液相色譜的幫助啦！

色譜(chromatography)是一種非常常見的分離手段，在醫藥，分析化學，化工領域廣泛的使用。通俗的解釋呢，是利用固定相和流動相的特性進行分離。比如說我們常見的用沙子凈水，就是發現沙子的細孔只能允許小分子水的通過，再大的物質就留在了沙孔里。這就是靠物質大小進行分離。當然我們還可以靠帶電性，生物特異性結合，親水性，疏水性，生物標籤等多種方式分離。
如果是大分子病毒的衣殼蛋白，我們還需要體外組裝起來。最後一個可愛的病毒外殼就被我們創造出來啦。

病毒分離培養主要有雞胚培養法和細胞培養法，這裡只大致介紹下理論知識，具體操作步驟及所用儀器和試劑都有標準，就不介紹了。
雞胚是發育的機體，適合許多人類和動物病毒及立克次氏體的生長增殖，常用於痘類病毒、粘液病毒和皰疹病毒的分離、鑒定、抗原製備、疫苗生產以及病毒性質等方面的研究。
雞胚培養病毒常用的接種途徑包括絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔以及卵黃囊接種四種。根據不同病毒，不同實驗目的以及不同來源的標本，選擇不同的途徑接種雞胚進行培養，即可達到分離培養病毒和傳待病毒的目的。
細胞培養是指將生物體內的部分組織移出體外，在人工控制的條件下，對由組織分散成的單個細胞或某一型細胞群進行體外培養，使其正常生長繁殖的技術，包括原代細胞培養和傳代細胞培養，在病毒分離中最常用的是傳代細胞培養。
因不同細胞對病毒的敏感性有差異，在進行病毒分離培養前，應首先選擇細胞的種類，以保證病毒的檢出率。比如Vero/SLAM細胞培養麻疹病毒。

我在實驗室分離過細菌病毒，就是噬菌體。這個不難，首先明確宿主菌，比如熟悉的大腸桿菌，先採集土樣或者水樣，用液體牛肉膏蛋白腖進行搖培，同時要加入宿主菌即大腸桿菌，搖培12～18個小時（沒有嚴格時間要求）後，離心，細菌過濾器過濾，得到原液。然後就是宿主菌與原液放一起靜置15分鐘左右，倒雙層牛肉膏平板培養，之後會有噬菌斑出現。大概過程是這個樣子，沒有講太詳細，但是這個方法確實可以分離的到。現在很多實驗室都做噬菌體，分離方法可能有些差別。