合成大片段基因的瓶頸是什麼？我們離人工製造一個生物還有多遠？

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我們已經得到了許多物種的完整鹼基序列，卻仍然無法將其基因人工合成，目前也僅成功了序列較短的酵母菌基因。為什麼基因合成做不到像3D列印一樣？大片段基因合成的難點是什麼？我們離人工製造一個生物還有多遠呢？

謝邀，正如評論所說，每一句問題描述都是一個課題。對於我這種得個目的片段用PCR，合成DNA片段找公司的人來說，我尚未遇到瓶頸哈哈。對於題主的問題也只能翻翻文獻給個我認為能解釋的答案。

回答這個問題，不明確的地方有：大片段基因有多大，多少bp算大？題主所指的基因概念模糊，是單個基因還是基因組？目前單個基因以及多個基因的合成技術很成熟了，但是大片段的（≥100kbp）DNA合成研究的較少，難度也很大。

目前人工合成基因的方法除了從自然界中獲取樣品再通過PCR（聚合酶鏈式反應）擴增外，就是用化學合成的方法合成而不需要模板。化學方法合成主要是固相亞磷醯胺三酯法，原理看下面參考文獻，也有其他人提到了，合成的寡核苷酸鏈越長，得率越來越低，出錯率越來越高，因此目前不可能用化學方法愣頭愣腦直接合成哇長哇長的DNA片段。
大片段DNA合成的基本策略是：
1、將dNTP(也就是原料)按照要求的DNA序列合成寡核苷酸；
2、將寡核苷酸組成較短的DNA序列（400-600bp）；
3、將短的DNA序列通過融合連接的方法連成長的基因序列（＞1kbp）；
4、通過普通的酶連接法或細胞體內重組合成更長的基因和組成基因組的長片段(≥ 10kb)；
5、在大腸桿菌及酵母中依次組裝，最後達到超過1 Mb的基因組；
6、將合成的基因組移植到細胞中去，並使合成的基因組的基因按要求表達。

大片段基因的合成難點在哪？
大致的理由其他人也說了，DNA長，周期長、易出錯。
1、合成成本高。合成1Mbp的雙鏈DNA大約需要20w美元。這只是鹼基的價錢，還有時間、基因設計分析等等；
2、DNA合成過程易出錯，出錯概率在1-11個/kbp,那麼，每合成一段DNA則需要測序比對，找到突變位點並修復，這個過程複雜又漫長；

我們離人工製造生物還有多遠？
世界上有很多課題組有基因合成和人工生命合成嘗試。想要得到像人這樣複雜的生命體還要很久，目前都是合成原核生物的基因組。以下是個例子：
2010年《Science》雜誌發表的文章「Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome」介紹了 J. Craig Venter課題組人工合成1.08Mbp的基因組導入到 M. capricolum的受體細胞中並創造出新的M. mycoides細胞，可以認為是人工合成的生命結構，該細胞內只含人工合成的DNA序列並且有預期的表型，同時能夠連續複製。
下圖是該課題組人工合成基因的方法

大致流程是在體外合成110個10kbp的DNA（藍色片段）並在酵母細胞中裝配，這110個DNA片段10個為一組連成11個100kbp的片段（綠色片段），最後將這11個大片段連接成基因組（紅色環）。整個基因組包括4個watermarker及若干酶切位點以保證有選擇性標記。

其實單純的合成大片段基因只要有錢有時間有精力，慢慢搞肯定能搞出來，更難的在於基因的排列、非結構基因分析、代謝通路、蛋白組學的研究等等，這些問題沒有解決的情況下，人造生物的合成那還差得遠。

不知此回答題主滿意否 @袁霖
參考：Gibson DG et al. Creation of a bacterial cell controlled by achemically synthesized genome. Science, 2010, 329: 52-56
王冬梅.從鹼基到人造生命——基因組的從頭合成.生命的化學

關於合成DNA的原理，樓上各位已經介紹很多了。的確，目前在DNA分子的合成層面，最大的技術困難就是如何合成長鏈的DNA分子。另一個重要的問題是，合成的DNA分子如何進行高效的組裝？

傳統的限制性內切酶效率低、限制多；新興的gibson assembly方法依賴於PCR，但只要是PCR，在基因組水平的DNA組裝上，就一定會發生突變；不依賴於PCR的golden gate方法目前是最可靠最高效的方法，新近一系列基因組水平DNA合成的文章大都採用了此方法。然而即便如此，也只是一次組裝5~8個長度在1k~2k之間的片段，比起基因組水平動輒以百萬鹼基作為單位的長度，還是小巫見大巫。

通量低必然導致成本高，也就成了合成大片段DNA的最大門檻。

贊同 @胡盼和 @甘小小的回答，人工合成大片段基因第一步就是合成長核苷酸鏈的問題，因為核苷酸是一個個加上去的，即使每一步得率都很高，但一旦長了就沒有辦法。現在我們在invitrogen合成引物（單核苷酸鏈），單條在56個（好像？）核苷酸以下的一個價，56個以上的另一個價，最長不能超過120個（好像？），這似乎就是目前用固相亞磷醯胺三酯法合成引物的極限了。
因為基因組是雙鏈的，我們可以通過合成互補的兩條單鏈退火得到需要的雙鏈，這樣得到的不過是一百來個鹼基對的DNA雙鏈。而最小的有細胞結構的生物的基因組也有160kb之巨。
為了得到更長的DNA雙鏈，我們可以用分子生物學的工具來做到。比如，在模板存在的情況下，我們可以通過PCR的方法，使用高保真的聚合酶，一次性擴增產生10kb以上的片段；我們還可以通過限制性內切酶和連接酶的工具，將多個DNA片段連結上；我們也能通過使用quikchange誘變的方法對DNA序列進行小範圍的修改；我們還能通過BAC、YAC等載體將得到的超長片段在細菌或酵母內保藏、擴增。如果不考慮基因組的裝配，以現在的技術，我們是能夠獲得長達一萬kb的DNA雙鏈的，請看這貨的工作：JCVI: First Self-Replicating, Synthetic Bacterial Cell Constructed by J. Craig Venter Institute Researchers。
基因合成無法做到像3D列印的原因是尺度不同，3D列印是在宏觀尺度上材料的構築，而基因合成是在分子尺度上的化學反應，它們的原材料服從的物理規律不一樣。除非咱能得心應手地操作單分子。
如果我們硬要從一堆無機物，de novo做一個生命出來，俺不知道還有多遠，不過樂觀估計是以十年為單位計算的。這個問題可能是沒有意義的，因為以現有的生物資源，我們似乎只用在它們的基礎上進行修改、不斷地修改，就能夠滿足人類的需求了。而這樣的事情，不是有人在做么？此所謂：轉基因。

@袁霖謝邀，我的答案就作為 @張浩千和 @胡盼的補充。

最大的瓶頸就是error rate還是太高，生物體內合成，拿人的DNA polymerase II來講，出錯率是10^-10（AT，GC配對10^-3，長鏈歧視其他配對10^-2，proofreading10^-2，之後的修復10^-3），這樣的精確度確保了合成1mbp 或1000kbp都有99.9%的正確率，自然不是問題。
但是人工合成的現在還基本依賴PCR技術，而最初用到PCR的Taq酶有10^-5的出錯率（配對和長鏈歧視）。現在改進的我就不清楚了，但肯定沒有之後修復機制的10^-3，即便出錯率降低到了10^-6，合成大片段正確率依舊很低。
這就是個數學問題：正確合成率 = (1 - 出錯率)^(bp數)
10^-5出錯率合成10kbp正確率是90%，100kbp正確率是36.8%。
10^-6出錯率合成10kbp正確率是99%，100kbp正確率是90%，1mbp正確率是36.8%。
10^-10出錯率合成1mbp大約是99.9%的正確率，合成10mbp正確率是99%。
結果顯而易見。

問題在於連接效率。片段越長連接效率越低。

因為沒有這方面的需求。具體的回頭補充。

被催了簡單說兩句，我們現在對生命的認識，都是基於已有生命來的，因此合成新生命，最簡單的辦法還是基於已有生命的改造。

合成越到後面，效率越低。最後得到的產物少得可憐，又有非常多的雜片段，得想辦法純化。

吐槽下知乎不能編輯表格還要我截圖。
大腸桿菌複製相關蛋白

我的意思很簡單，就算是大腸桿菌這麼簡單的原核生物，DNA複製都需要這麼多酶。
目前基本上合成DNA都是用的化學方法，想要完整不出錯的複製完高等生物那幾個G的DNA鏈，難度不下於猴子隨意敲鍵盤，結果打出來一部莎士比亞全集。

關於題主最後一個問題，有興趣可以研究下一門叫做合成生物學的學科。

如果你能完全人工合成一大段完整、自洽的基因序列，也就意味著你可以創造一個生命。基因都是「活著」的。基因不是計算機程序代碼，裝在硬碟里就可以實現調用、運行、拷貝等等。這也是DNA測序計劃完成數十年後，再也沒有什麼飛躍性進展的原因之一。人類想要工業化利用已知的基因序列知識，目前還很難。這也是為什麼網上很多人吐槽生物科學研究周期慢、效率低的原因。

1.模擬活體生物分子活性所需的環境，代價太過昂貴。很多生物分子，包括基因序列，都只是在人體的某個非常苛刻的環境下才發揮那一點點作用，採用理科的思維，將其剝離到人工環境下觀察，需要的代價太大。

2.尋找可以被人類利用，來進行簡單而精確的邏輯操作的「工具酶」很難（酶是由生物自己產生的，生物進化到現在不可能會允許自己的基因被別人隨意當作「工具」）

3.這類研究經濟效益很低。人體本身就是一個最好的「生物工廠」，就算你費盡心機去摸透了人體所有基因的表達和運行方式，我們大部分人還是該吃吃，該喝喝。並且，從倫理上、道德上，想要改變生命自身的規律是「禁忌」的。連一個「轉基因」食品，各界人物都可以在完全不知內情的情況下隨意品評的社會，大刀闊斧地深入研究，很難。

以上三點，可以看出生物研究、基因研究還處在「黑箱實驗」階段。類似於物理學中的「薛定諤之貓」的表述。我們的實驗對象、實驗途徑都是自己不可控制的。我們產出的產品甚至可能不如野花野草熬成的苦水湯有效。對於這些，我們只能「講道理」。但是道理，永遠在消費者一邊。

以上。

十年之後，我終於等到了這一刻。
眼前，積滿灰塵的試驗台上，整整齊齊擺滿的，是七七四十九台24k純金鑲鑽的PCR儀，不會有人知道，為了集齊它們，這十年之間，我走過了多少地方，越過了多少艱難險阻，付出了怎樣的艱辛努力。
隨手倒滿一杯香醇的EB溶液，我的心裡，早已悲傷逆流成河。
十年之前，我便早已明白，人工合成大片段基因的瓶頸，也不過是三件事，足夠好的運氣，足夠多的金錢，以及不顧一切的勇氣。
當然，如果不是遇見她，這一切都還無從談起。
那是十年之前的某個昏黃夏日，在校園的一角，吃完八個炸雞腿，我無意中輕輕回眸，剛剛好看到白衣飄飄、笑靨如花的她。
同學，你節操掉了。她指了指我隨手扔掉的塑料袋，輕啟朱唇，對我含笑低語。
人生若只如初見，疑是銀河落九天。
後來我從同學口中得知，她是生物系的系花，名字叫朱香翠。
攢巒業崿射朱光，丹霞翠霧飄奇香。美人四向回明璫，雪山冰谷晞太陽。那是多麼詩情畫意的名字。
我本以為，我這輩子都不會再去生化實驗室那種鬼地方了，但就是因為這怦然心動的瞬間，我決定改寫我的人生道路。
兩個月後，我如願轉到了生物系，和香翠成為了一個實驗室的同門。
每天，翠都在廢寢忘食的做實驗，她曾對我說，人類已經得到了許多物種的完整鹼基序列，卻仍然無法將其基因人工合成，目前也僅成功了序列較短的酵母菌基因。為什麼基因合成做不到像3D列印一樣？如果能完全人工合成一大段完整、自洽的基因序列，就可以升級我們人類自身，甚至可以創造出一個嶄新的生命，那將是一件多麼了不起的事。
每次聽她興高采烈的描述著她那流光溢彩的夢想，我都只會在她的身側，低著頭長久的沉默不語。
就算成功了那又如何，試想，被肆意改造升級的自己，還能算是原來的那個真實的自己嗎。
兩個月後的一天，她突然興高采烈地對我說，她已經推算出了最完善的試驗方法，那一刻，正在洗刷刷的我的手中的錐形瓶轟然落地。
她說，引物我已經設計好了，現在，就差集齊七七十四九個24k純金鑲鑽的PCR儀，然後，實驗便可以順利開展，我們便也因此將邁入一個全新的時代。
這是第一次，我看著她微笑的樣子，卻一點也高興不起來。
我只是試探著問她，那49個PCR儀該怎麼弄，要知道，她父親是攤煎餅果子的，她母親也是攤煎餅果子的，雖然月入不菲，但是能一下子拿出買49個純24k金鑲鑽的PCR儀的錢，也是有些困難的。
而我，雖然又高又帥，但是每個月的生活費也只有五百塊。
所以我在那時候還心存僥倖地想，她是不可能輕易開展那瘋狂的實驗的。
但是，天有不測風雲，人有旦夕禍福，福不雙至，禍不單行，行萬里路，讀萬卷書，書山有路勤為徑，學海無涯苦作舟。
當天晚上，一直哈哈哈哈哈大笑的翠突然提議請我吃大餐，她說，有一個驚天的好消息要告訴我，那時候，我隱隱的已經有了些不祥的預感。
那天，翠兒點了五盆我最愛吃的鍋包肉，可是，對我來說，卻是那般的食之無味，仿若嚼蠟。
她告訴我，她在知乎上發了一個帖子，把自己大概的想法說了出來，然後，一個神秘的黑衣人很快私信了她，決定無條件給她金錢上的幫助。並且，一個小時後就給她的賬戶上面打過來了100000000000000000000000000000000000000000000000000美元。
我當時好奇的問她，你怎麼知道那是一個黑衣人。
當時，她已經眉開眼笑的忘乎所以，竟還告訴我不要在意這些細節。
翠兒啊，收手吧，小心掉進萬劫不復的陷阱，我善意而理智地提醒她。
那錢已經打過來了，我也要開工了，你如果不支持我，就請安靜的走開。還有，希望你能夠暫時幫我保守秘密。
那晚，由於談的並不開心，鍋包肉我們吃的竟還剩了一盆，並且最終，倔強的我們還是鬧個不歡而散。
第二天，翠就從學校神秘地消失了，沒有人知道她去了哪裡，當時，我覺得我的世界都塌了。我萬萬沒有想到，她竟然會如此決絕地離開，只是為了那個危險的夢想。
於是，我毫不猶豫的退了學，背上行囊飛奔向火車站，不管天涯海角，我都要找到她！找到她！找到她！
人海茫茫，我也沒有什麼明確的目標，但我堅信，只要她暫時不離開地球表面，便總會留下些蛛絲馬跡。
當然，我是一個非常上進的陽光美男子，我在尋找她的同時，也一直不忘努力拚搏，最後，經過三年的不懈努力，我終於成了全球最大的生化集團之一——噗噗呼啦啦啦啦啦國際的總裁。為什麼是之一，因為，還有一個和我們在這方面勢均力敵的生化集團，叫做神秘生物集團，就和他們的名字一樣非常的神秘。
可是，這麼多年過去，我已悄然升職加薪，當上總經理，出任CEO，走上人生巔峰。可我卻依然沒有找到她。那個明媚憂傷的美麗女子，就彷彿人間蒸發了一般，再也沒有重歸我的視線。
這幾年，我一直都在拚命努力的收購各種大大小小的去研究人工合成大片段基因的科研機構，一是希望得到些關於翠兒的線索，二是我從始至終都是這項技術忠實的反對者。
我也知道，這項技術的實現可以使生物學研究進入一個嶄新的時代，但同時，我也知道，如果失控的話，它將給人類帶來怎樣的滅頂之災。
很不幸的，這滅頂之災，在幾億年前，我曾親身經歷過一次，並且，作為倖存者，我現在唯一的信念就是阻止這悲劇的再次重演。
那時候，我還不是現在這個模樣的我，只是一條普普通通的噗噗呼啦啦啦啦啦蟲，沒房沒車，也沒有像模像樣的好工作，但是每天還是活的非常開心噠，因為非常非常喜歡我的一個鄰居，一條非常非常非常美麗的女噗噗呼啦啦啦啦啦蟲。對了，我們族類可是當時地球的唯一智慧生命，蟲均智慧非常高，文化水平非常高，生活水平非常高，而且福利待遇也非常的好。並且，已經掌握了先進的合成大片段基因創造新物種的核心科技。
可是，天有不測風雲，人有旦夕禍福，福不雙至，禍不單行，行萬里路，讀萬卷書，書山有路勤為徑，學海無涯苦作舟。
一個無聊的傢伙突然有一天無意中培養出來了一種合成新物種——人類，他們的繁殖速度非常非常快，十幾二十年就能繁殖一代，要知道，我們種族繁殖一代需要一千年的時間啊！
後來，人類越來越多，越來越多，越來越多，並且，有一天，他們種族爆發了一種疾病，人流感，雖然，這種疾病對他們沒什麼大礙，但對我們的肉體來說，卻是完全致命的打擊，無論多麼高科技，根本就是無葯可醫。
最後，沒有辦法，一個噗噗呼啦啦啦啦啦科學家被逼研究出來一個新的技術，就是把我們的所有基因片段移植到一些人類的身上，這樣，這個噗噗呼啦啦啦啦啦蟲的思維便會完全佔領這個人類的思維，並且，這個被移植的人以後的世世代代，都會延續被移植來的那個噗噗呼啦啦啦啦啦蟲的全部思維，換句話說，我們只是把人類當做寄生的軀殼而已，並且，在某種層面上，我們得到了另一種意義上的永生。
可是，並不是所有人都願意生娃，或者能生出個娃，所以，經過幾億年之後，我想，像我這樣，寂寞而堅韌地存活下來的傢伙，應該已經寥寥無幾了吧。
我曾痛恨我這個陌生的樣子，討厭用別的種族的樣子這樣存活下去，即使，可以活的如此的久。但我也承認，我就是個懦夫，即使這樣自以為苟且地偷生，卻始終沒有自行了斷的勇氣。
這樣多年，我都無聊而低調的活著，看過很多很多不一樣的風景，不同的時代變革，變得越發的麻木與堅強，甚至，有時候，都覺得自己已然和人類沒有什麼不同了。
即使是使我們漸漸滅亡的人類，我漸漸也不再那麼的恨了，他們也無過錯，活下去，是所有文明的祈望，當自己的種族經歷那樣的磨難之後，我終於明白，沒有什麼，比活下去是更有意義有希望的事情了。
記得翠說過，人工合成大片段基因，說不定可以給我們帶來永生的希望。當時我沒有說，這也許是一把雙刃劍。
轉眼，十年過去。雖然對我而言，也不過僅僅是生命中的一瞬而已。
這十年，我前所未有的努力，終於，集齊了那49個24k純金鑲鑽PCR，要知道，那不僅僅是金的那麼簡單，複雜的技術讓它非常難以製作，所以，即使是當年得到那筆資金，她也不一定能弄出三台來。
我做這些，想法非常簡單甚至愚蠢，就是為了引她出來，我想在有生之年再見她一面。
我的有生之年也許會生生不息，但是她不一樣。
這麼多年，這是我第二次感受到愛上別人的感覺。所以，才會如此的不顧一切。
集齊之後，我在各大論壇貼吧放出話來，宣布我的公司集齊了所有硬體設備，今天晚上，就將開工正式實驗。地點，就是我多年前的學校的生物實驗室改裝的超級實驗大樓。
她會來吧。她一定回來的。我的潛意識不止一次這樣告訴自己。
半夜十二點。
呼啦一聲驚天動地，一隊全副武裝的人馬衝進了實驗室。沒錯，神秘集團的人，他們比我們更勝一籌的就是，連軍方都能聯合起來。
為首的，是一個美如畫的紅衣女子。
我就知道，你會來。
呵呵。她冷笑。把技術交出來，我或許會放你一條活路。她對我說。
十年前你是騙我的吧，你根本沒有研究出實驗方案，也沒有神秘黑衣人資助你，對不對。
她點了點頭。
你知道我掌握這個技術，就差那些PCR儀了對不對？我又問。
她又點了點頭。
我後來才知道，還是因為收買了你的貼身小秘書才知道的，你怎麼知道我的秘密的？這是困擾我十年的一個問題。
這一次，她看了我一眼，沉默不語。
當時為什麼不直接問我，讓我告訴你具體怎麼做。
因為沒錢啊，我想，給你些時日，你一定會想辦法籌齊經費去製造PCR的。
你可真了解我。我呵呵呵呵。
因為，我認識你很久了，很多年前，我們是鄰居啊，呵呵呵呵。
你你你你，敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦，我聽見自己吐血的聲音。
沒錯，我和你是同類，只不過我的信念和你的是完全相反的，我需要這個技術，恢復我們原本的樣子,想當年，不就是你發明了這個技術才使我們種族遭遇滅頂之災的么，現在，你就應該對此事負責……
敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦敦……可是，我已經聽不清她繼續再說神馬了，這麼多年，我從來沒有想過，我會因為過度悲傷百感交集，帶著這個核心技術，吐血離開人世。
於是，人工合成大片段基因的瓶頸將繼續存在，至於接下來大家會怎麼去突破瓶頸，就和我沒有半毛錢關係了。。。。。。。。。。。。

即便是每一步產率都有95%，每一步能精確連接1個核糖，那麼1000個核糖的單鏈DNA總產率就是0.95的1000次方 5.29e-23....
有機狗內流滿面，全合成狗倒地不起_(:з」∠)_

@袁霖瀉藥，問題提得非常好，我就曾幻想有一種分子攝影機，它可以像拍電視似得記錄細胞內各種分子的動態，那樣我們就不必去驗證各種分子機理（誰激活誰，誰抑制誰，誰和誰一同發揮作用blabla），不去花大量的時間制樣做電鏡，我們想知道什麼看個video 就好了么。但是我們不能，因為目前工程技術還不能夠達到這樣隨心所欲的水平。利用3D列印技術合成全基因組，從分子層面操縱生命？現階段同理也不能實現。直接獲得大片段基因，只能藉助克隆科學網—科學家發現直接克隆大片段DNA方法。而所謂的從頭合成大片段基因，是靠一小段一小段的DNA拼接而來，其中的緣由知友已經解釋過了，不再詳述。我們可以寄希望於工程師，或許他們能設計出3D列印分子技術？！也未可知。
話說回來，即便能夠合成基因，也不意味著能夠製造生命，這樣有點唯基因論了。
細胞的生命是由其物質環境和能量環境所控制的，而不是其基因。基因只不過是用於細胞、組織和器官構造的分子藍圖。而環境卻像一個「承包商」，解讀、運用那些基因模型，並最終為細胞的生命性狀做準備。使生命機制投入運作的，是單個細胞對環境的「認知」，而不是基因。——《信念的力量：新生物學給我們的啟示》美布魯斯·H·利普頓
我的理解，合成基因是製造生命的一小步。一個很有意思的人——克萊格·凡特已經開始著手研究，參見人造生命。他的團隊用合成一段基因，置換一個自然細胞的基因組，得到了Mycoplasma laboratorium，這大概是我們現階段為人工製造生命做出的努力，但正如克萊格自己所說的「我們並不認為這是『從零開始創造生命』，更確切地說，我們能用合成的DNA，從已經存在的生命創造新生命。」
總之，實現de novo 合成生命，「任重而道遠」。

怎麼debug？

錢

因為真的很難「精確合成」

就像你弄出個10節車廂的火車還好，弄出個100000節車廂的火車，有點難度

離人工製造生物距離大概100年吧，當然，人工修改也許六七十年就可以做到